Hiện nay, có 3 phương pháp chính để sản xuất prebiotic [12,21,31,33,58]:
(1)Phương pháp vật lý: Chiết tách trực tiếp oligosaccharide tự nhiên từ thực vật:
• Oligosaccharide đậu nành từ whey đậu nành
• Inulin từ chicory
• Tinh bột bền từ ngô.
(2)Phương pháp hóa học: Chuyển hóa có xúc tác từ carbohydrate:
• Lactulose từ quá trình đồng phân hóa lactose trong môi trường kiềm.
• Lactitol từ quá trình hydro hóa lactose.
• Agaro-oligosaccharide từ thủy phân bằng acid hydrochloric, acid citric.
(3)Phương pháp enzyme:
Thủy phân có kiểm soát polysaccharide tự nhiên, có thể có thêm quá trình sắc kí để tinh sạch prebiotic:
• FOS từ inulin (enzyme inulinase)
http://www.ebook.edu.vn 25
• Pectic-oligosaccharide từ pectin (pectin đậu nành, enzyme endo-
polygalacturonase)
Glycosyl hóa - quá trình tổng hợp bằng cách sử dụng enzyme thủy phân và/hoặc glycosyl transferase có nguồn gốc từ thực vật hoặc vi sinh vật, có thể có thêm quá trình sắc kí để tinh sạch prebiotic:
• GOS từ lactose (β-galactosidase)
• ScFOS từ sucrose ( β-fructosyltransferase) hoặc fructose
• Lactosucrose từ lactose và sucrose (β-fructo-furanosidase)
• Gluco-oligosaccharides từ sucrose (enzyme dextran sucrase)[9,19,60,71,88].
Quá trình chiết xuất hóa học oligosaccharide từ thực phẩm có thể làm cho sản phẩm có màu hay hương vị không mong muốn. Ngoài ra, chế phẩm prebiotic thu được thường là hỗn hợp các polysaccharide với độ dài ngắn khác nhau. Đôi khi, sự hiện diện của các mono- và disaccharide có thể làm giảm tính chọn lọc của prebiotic. Phương pháp enzyme tạo sản phẩm ít lẫn sản phẩm phụhơn [12].
Hình 2.6. Sơ đồ sản xuất một số prebiotic theo các phương pháp khác nhau ( Sako et
al,1999).[31,113]
Chiết tách Chiết tách
Glycosyl hóa
Glycosyl hóa Thủy phân và Glycosyl hóa
Đồng phân hóa Whey đậu nành Raffinose FOS Lactosucrose Lactulose GOS IMO Oligosaccharide đậu nành Glycosyl hóa Sucrose Lactose Chiết tách Thủy phân Chiết tách Thủy phân Củ cải đường Sữa bò Đậu nành Tinh bột Xylan XOS
http://www.ebook.edu.vn 26
Bảng 2.4. Các nhà sản xuất prebiotic trên thế giới [58]
Tên công ty và địa chỉ Tên sản phẩm Đặc điểm sản phẩm
Galactooligosaccharides
Yakult Honsha Co. Ltd., Nhật Bản www.yakult.co.jp Oligomate 55 Oligomate 55P TOS-100 Syrup chứa 75% (w/v) rắn Oligosaccharide >55% rắn Dạng bột, Oligosaccharide >55% Dạng bột, Oligosaccharide >99% Nissin Sugar Mfg. Co. Ltd., Nhật Bản
www.nissin-sugar.co.jp Cup-Oligo H-70 Cup-Oligo P Syrup chứa 75% (w/v) rắn Oligosaccharide ~70% rắn Dạng bột, Oligosaccharide ~70% Friesland Foods Domo, Hà Lan
www.borculodomo.com
Vivinal GOS Syrup chứa 75% (w/v) rắn
Oligosaccharide ~60% rắn
Lactulose
Morinaga Milk Industry Co., Nhật Bản www.morinagamilk.co.jp MLS-50 MLC-A Syrup chứa 70% rắn, Lactulose ~70% rắn Bột (anhydride), lactulose 98% Solvay, Đức www.solvay.com Duphalac Cephulac Syrup chứa >70% rắn, Lactulose >74% rắn Dạng bột, lactulose > 95% Lactosucrose
Ensuiko Sugar Refining Co., Nhật Bản www.ensuiko.co.jp Nyuka-Ogiro LS-40L Nyuka-Ogiro LS-55L Nyuka-Ogiro LS-55 Syrup chứa 72%(w/v) rắn Lactosucrose ~ 42% rắn Syrup chứa 75%(w/v) rắn Lactosucrose ~ 55% rắn Bột, lactosucrose ~ 55% Hayashibara Shoji Inc., Nhật Bản
www.hayashibara.co.jp Newka-Oligo LS-35 Newka-Oligo LS-55L Newka-Oligo LS-55P Syrup chứa 72%(w/v) rắn Lactosucrose ≥ 35% rắn Syrup chứa 75%(w/v) rắn Lactosucrose ≥ 55% rắn Bột, lactosucrose ≥ 55% Lactitol PURAC, Hà Lan www.purac.com LACTY Bột, lactitol 96% Danisco www.danisco.com Lactitol Finlac DC Bột Bột Fructooligosaccharides
http://www.ebook.edu.vn 27
www.meiji.co.jp Meioligo G Syrup chứa 75% (w/v) rắn
Oligosaccharide ~55% rắn Beghin-Meiji Industries, Pháp www.beghin-say.fr Actilight P Actilight G Bột, Oligosaccharide 95% Syrup chứa 75% (w/v) rắn Oligosaccharide ~55% rắn
Golden Technologies Co., GTC Nutrition, Mỹ
www.nutraflora.com
NutraFlora scFOS Bột, Oligosaccharide 95%
Oligofructose và Inulins Beneo-ORAFTI, Bỉ www.beneo.orafti.com Orafti L60 Orafti L85 Orafti L95 Orafti P95 Orafti Synergy1 Orafti ST Orafti HP Syrup chứa 75% (w/v) rắn Oligosaccharide > 60% rắn Syrup chứa 75% (w/v) rắn Oligosaccharide > 85% rắn Syrup chứa 75% (w/v) rắn Oligosaccharide > 95% rắn Bột, oligosaccharide >95% Bột, hỗn hợp inulin và oligofructose. Bột, inulin > 90% Bột, inulin > 99.5% Cosucra SA, Bỉ www.cosucra.com Fibrulose F90 và F97 Fibruline Oligofructose Inulin Sensus C.V., Hà Lan www.sensus.nl Frutafit-inulin Bột Isomaltooligosaccharides
Showa Sangyo Co., Nhật Bản www.showa-sangyo.co.jp Isomalto-500 Isomalto-900 Isomalto-900 Syrup chứa 75% (w/v) rắn Oligosaccharide > 50% rắn Syrup chứa 75% (w/v) rắn Oligosaccharide > 85% rắn Bột, oligosaccharide >85% Nihon Shokuhin Kako Co., Nhật Bản
www.nisshoku.co.jp Biotose # 50 Panorich Syrup chứa 75% (w/v) rắn Oligosaccharide > 50% rắn Syrup chứa 75% (w/v) rắn, Oligosaccharide ≥50% rắn, có panose ≥ 25%
Hayashibara Shoji Inc., Nhật Bản www.hayashibara.co.jp
Panorup Syrup chứa ≥74% (w/v) rắn,
http://www.ebook.edu.vn 28
có panose ≥ 25%
Soybean-oligosaccharides
The Calpis Food Industry Co., Nhật Bản www.calpis.net Soya-oligo Syrup chứa 75% (w/v) rắn soybean-oligosaccharides 35% rắn Xylooligosaccharides Suntory Ltd., Nhật Bản www.suntory.com Xylo-oligo 70 Xylo-oligo 20P Xylo-oligo 35P Xylo-oligo 95P Syrup chứa 75% (w/v) rắn Oligosaccharide ~70% rắn Bột, oligosaccharide ~20% Bột, oligosaccharide ~35% Bột, oligosaccharide ~95% Tinh bột bền
Penford Australia Ltd., Australia www.penford.com
Hi-Maize Culture-Pro National Chemical & Starch
Company, Mỹ www.nationalstarch.com Hylon VII Novelose 330 Novelose 240 2.5. Probiotic và synbiotic 2.5.1. Probiotic
Năm 1905, tiến sĩ người Nga Elie Metchnikoff là người đầu tiên viết về lợi ích đối với sức khỏe của vi khuẩn lactic có trong sữa chua Bulgaria. Những người nông dân Bulgaria đã sử dụng sữa chua thường xuyên và liên tục đều sống lâu và khỏe mạnh [65, 76, 103]. Từ đó, có nhiều công bố về lợi ích sức khỏe do vi sinh vật trong thực phẩm lên men mang lại.
Tuy nhiên, thuật ngữ ‘probiotic’, theo tiếng Hy Lạp có nghĩa là ‘dành cho s ự sống’, xuất hiện đầu tiên bởi Lilly và Stillwell vào năm 1965 để mô tả những chất do một loại vi sinh vật tạo ra để kích thích sự phát triển của vi sinh vật khác cùng loại.
Kể từ đó, có nhiều định nghĩa probiotic được đưa ra với những quan điểm đối lập nhau là phải duy trì khả năng sống của probiotic hay không cần duy trì. Năm 2001, một ủy ban giữa Tổ chức Nông lương thế giới (FAO) và Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã định nghĩa probiotic như sau: ‘đó là những vi sinh vật sống, khi được cung cấp đủ sốlượng, sẽ mang lại sức khỏe cho vật chủ’ [27, 58, 85, 90, 111]. Định nghĩa này nhấn mạnh lại tầm quan trọng của khả năng sống của probiotic trong sản phẩm và được chấp nhận trên toàn cầu [27].
http://www.ebook.edu.vn 29
*Bact: bacteroides, Bif: bifidobacteria, Clost: clostridia, Coli: E.coli, Eub: eubacteria, Lab: lactobacilli
(a)hệ vi sinh vật sau khi bổ sung prebiotic
(b)hệ vi sinh vật trước khi bổ sung prebiotic và probiotic (c)hệ vi sinh vật sau khi bổ sung probiotic
Hình 2.7.Tác động của prebiotic và probiotic đến hệ vi sinh vật ruột già. [32]
Dựa vào những nghiên cứu lâm sàng về tác dụng có lợi của probiotic đối với sức khỏe con người, người ta đưa ra những đặc tính cần có của vi sinh vật probiotic như sau: [36, 40, 85, 118]
1. Có nguồn gốc từ hệ vi sinh vật đường ruột của người. 2. Tồn tại được dưới những điều kiện vật chủ
3. Sinh sản nhanh và/hoặc chiếm ưu thế trong ruột già
4. Tồn tại được với hệ miễn dịch và chống lây nhiễm của vật chủ 5. Kích thích miễn dịch đối với hệ thống miễn dịch của chất nhầy 6. Sản sinh các hợp chất kháng sinh
7. Chống chất gây ung thư và vi khuẩn gây bệnh
8. Được đánh giá là an toàn, không gây bệnh, không độc, không dị ứng, không gây đột biến, hay không gây ung thư
9. Ổn định, không có plasmid sao chép 10. Có đặc tính công nghệđể dễứng dụng
11. Hoạt động trao đổi chất theo hướng có lợi cho sức khỏe 12. Tác dụng tốt đối với sức khỏe
13. Có khảnăng để tái tổ hợp protein và peptide Mô ruột/chức năng
http://www.ebook.edu.vn 30
Cho đến nay, vi sinh vật probiotic hay được gọi là probiotic được phát hiện bao gồm: Lactobacillus, Bifidobacterium, Propionibacterium, Bacillus, Escherichia, Enterococcus, và Saccharomyces (bảng 2.5). Trong đó, Lactobacillus và
Bifidobacterium là 2 loài lý tư ởng để kết hợp với thực phẩm. Chúng tồn tại trong ống tiêu hóa, chịu được acid và mật, có khảnăng bám vào các tếbào đường ruột, và là loại GRAS [27,78]. Lactobacilli được sử dụng trong thực phẩm nhiều hơn bifidobacteria vì bifidobacteria có nguồn gốc trong đường ruột, nhạy cảm với oxy, yêu cầu điều kiện phát triển khắt khe hơn nên ít có tính công nghệ hơn. Ngoài propionibacteria và enterococci, các loài khác thường không được sử dụng trong thực phẩm lên men nhưng được sử dụng để làm thành phần bổ sung chếđộ dinh dưỡng ở dạng viên nang, bột,…[27].
Bảng 2.5. Các vi sinh vật probiotic [95]
Nguồn: Holzhapfel và cộng sự (2001).
Probiotic khó vượt qua được các acid hay enzyme như prebiotic [98], do đó, liều lượng sốlượng vi sinh vật probiotic trong sản phẩm thực phẩm phải đạt tối thiểu là 107 tếbào/ml đểđảm bảo hiệu quả tác dụng của probiotic [27, 97].
http://www.ebook.edu.vn 31
Probiotic được sử dụng nhiều trong các sản phẩm sữa lên men, đặc biệt là yogurt [37], thường được gọi là bio-yogurt [95].
2.5.2. Synbiotic
Năm 1995, Gibson và Roberfroid đã đưa ra định nghĩa synbiotic, là ‘một hỗn hợp của probiotic và prebiotic có tác dụng tốt đối với sức khỏe vật chủ, bằng cách cải thiện khảnăng sống sót và bám trụtrong đường ruột của chất bổ sung chứa vi sinh vật sống, bằng cách kích thích chọn lọc sự phát triển và/hoặc hoạt động trao đổi chất của một hay một vài loại vi khuẩn có lợi và do đó cải thiện sức khỏe vật chủ’ [31].
Sử dụng synbiotic nhằm kích thích sự phát triển hoặc hoạt động của vi khuẩn bifidobacteria và lactobacilli ban đầu có trong đường ruột bằng cách sử dụng kết hợp carbohydrate thích hợp với một hay một vài chủng probiotic. Khi đó, prebiotic có thể bảo vệ probiotic trong quá trình tiêu hóa đ ể đảm bảo tính ổn định của nó khi đến ruột già. Ngoài ra, prebiotic có thểtăng cường sự phát triển của chủng preobiotic và của hệ vi sinh vật đường ruột [12, 90]. Qua các nghiên cứu, người ta thấy synbiotic có thể tác dụng ở cả ruột non và ruột già [12, 31, 45].
Bổ sung synbiotic (gồm probiotic và prebiotic) vào sản phẩm sẽ tăng chi phí sản xuất và tăng giá cả của sản phẩm. Vì vậy, thị trường các sản phẩm synbiotic phát triển chậm hơn so với các sản phẩm chứa probiotic và sản phẩm chứa prebiotic. Mặt khác, các vi khuẩn trong sản phẩm chứa probiotic có thể tổng hợp oligosaccharide ngay trong sản phẩm nhưng với sốlượng rất hạn chế [80, 93].
http://www.ebook.edu.vn 32
CHƯƠNG 3: CÁC PREBIOTIC ĐƯỢC BỔ SUNG TRONG CÁC SẢN PHẨM SỮA 3.1. Galactooligosaccharide (GOS)
3.1.1. Giới thiệu về GOS
Galactooligosaccharide là prebiotic có trong sữa, được sinh tổng hợp từ lactose [32, 88]. GOS có trong sữa mẹ với lượng rất thấp khoảng 1 g/l, tồn tại với lượng vết trong sữa bò và yogurt [32].
Trước kia, GOS được xem là sản phẩm phụ trong công nghiệp chế biến sữa GOS
[28,32,38]. Đó là kết quả hoạt động của enzyme β-galactosidase của canh trường nuôi
cấy trong sữa lên men. Tuy nhiên, người ta thấy rằng, một lượng GOS rất nhỏ trong sữa mẹ góp phần thiết lập hệ vi sinh vật có lợi trong đường ruột của trẻ được nuôi bằng sữa mẹ. Trong đó, bifidobacteria là loại vi khuẩn chiếm ưu thế [21,32].
GOS là hỗn hợp gồm các oligosaccharide được cấu tạo bởi các đơn vị β-(1-4) galactopyranosyl thường được nối với nhau bởi liên kết β-(1-6) hay β-(1-4) và có thể có gốc glucopyranosyl ởđầu khử thông qua liên kết β-(1-4). Trisaccharide có thểđược gọi là 4’- hoặc 6’-galactosyllactose nếu liên kết giữa các gốc galactose là β-(1- 4) hay β-(1-6). Mức độ polymer hóa (DP) của GOS là 2 – 10 [18,21,52,93,94].
Hình 3.1. Cấu trúc phân tử của GOS [36]
GOS được sản xuất theo phương pháp enzyme có thể được gọi với nhiều tên gọi khác nhau: transgalacto-oligosaccharides, transgalactosylated oligosaccharide, trans- GOS, TOS, hay oligogalactosyl-lactose [21].
http://www.ebook.edu.vn 33
3.1.2.Kỹ thuật sản xuất GOS
GOS được sản xuất thương mại bằng phương pháp enzyme, bởi hoạt tính transgalactosyl của β-galactosidase sử dụng cơ chất lactose [40].
3.1.2.1.Enzyme tổng hợp GOS
Tên gọi: Enzyme β-galactosidase hay β-D-galactoside galactohydrolase (EC 3.2.1.23) là enzyme được gọi với tên thường là lactase [38,49,64].
Nguồn gốc: β-galactosidase tồn tại trong thực vật ( đào, mơ, hạnh nhân), động vật (mô ruột, não, da) và vi sinh vật (nấm men, vi khuẩn, nấm mốc) [31,35,49,73]. Enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật cho hiệu suất cao nên được sử dụng để sản xuất thương mại [18, 31, 38, 64].
Trong sản xuất GOS thương mại, các enzyme được chiết tách chủ yếu từ các giống: Kluyveromyces, Aspergillus, Streptococcus, Bacillus, Cryptococcus (bảng 3.1) [18, 49, 77].
Ngoài ra, enzyme β-galactosidase cũng đư ợc tìm thấy trong các loài vi khuẩn
probiotic [18, 49]. Những loài vi khuẩn probiotic có thể tổng hợp GOS như:
Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium bifidum BB, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium angulatum, and Bifidobacterium
infantis[31], Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus,
Lactobacillus animalis, Lactobacillus reuteri [57]. Sản phẩm oligosaccharide của những loài này sẽ được chuyển hóa dễ dàng hơn bởi vi khuẩn probiotic trong đường ruột. Sản phẩm tạo thành là hỗn hợp gồm những oligosaccharide mạch thẳng hoặc nhánh [18, 31].
Đặc điểm:Enzyme β-galactosidase có kích thước phân tử là 36 – 362 kDa, chứa 4 subunit [35, 91]. Enzyme từ nấm men và vi khuẩn là enzyme nội bào và enzyme từ nấm mốc là enzyme ngoại bào [49, 64]. Vì vậy, trong sản xuất GOS, enzyme từ nấm men và vi khuẩn phải được chiết tách ra khỏi tế bào. Enzyme từ nấm mốc được thu nhận trong canh trường nuôi cấy [18].
http://www.ebook.edu.vn 34
Bảng 3.1. Một số loài vi sinh vật được sử dụng trong sản xuất GOS thương mại
[62, 64] Loài vi sinh vật pH tối thích Nhiệt độ tối thích Sản phẩm ban đầu và kiểu liên kết Kluyveromyces marxianus ssp.lactis 6.0 – 7.0 37 – 45 6’-galactosyllactose
Kluyveromyces fragilis 6.9 – 7.3 40 – 44 6’-galactosyllactose
Aspergillus oryzae 3.5 – 6.5 50 – 55 6’-galactosyllactose
Aspergillus niger 3.0 – 4.0 55 – 65 6’-galactosyllactose
Streptococcus thermophilus 6.5 – 7.5 55 - 57 3’-galactosyllactose
Bacillus circulans 6.0 55 – 60 4’-galactosyllactose
Bacillus stearothermophilus 6.0 – 6.4 50 – 65 4’-galactosyllactose
Cryptococcus laurentii 4.3 55 - 60 4’-galactosyllactose
Cơ chế tổng hợp GOS:Enzyme β-galactosidase có nguồn gốc từ nhiều loài vi sinh vật khác nhau sẽ có các đặc tính khác nhau như khối lượng phân tử, độ dài mạch polypeptide, và vị trí của trung tâm hoạt động [38,64]. Tuy nhiên, chúng đều có các amino acid như nhau ở trung tâm hoạt động. Đó là histidine đóng vai trò như là m ột chất ái nhân/base (nhận proton) và cysteine như là một acid (cho proton). Hiện nay, có một giả thiết mới là β-galactosidase từ các vi sinh vật khác nhau có 2 gốc acid glutamic (Glu482 và Glu551) ở trung tâm hoạt động. Một gốc acid glutamic như là chất cho proton và gốc acid còn lại là chất nhận proton. Chúng tham gia đồng thời trong phản ứng enzyme [18,38]:
• Bước đầu tiên được gọi là bước glycosyl hóa. Một acid carboxyl ở trung tâm hoạt động cho một proton vào nguyên tử oxy liên kết [18], giải phóng glucose [38,55]. Đồng thời, một acid carboxyl khác gắn vào galactosyl như là một chất ái nhân [18], hình thành phức enzyme-galactosyl [38,55]
• Bước thứ hai là bước deglycosyl [18]. Phức enzyme-galactosyl được chuyển đến một chất nhận chứa nhóm hydroxyl [38,55]. Acid carboxyl thứ nhất đã cho một proton sẽ hoạt hóa chất nhận chứa nhóm hydroxyl, bằng cách nhận proton từ chất nhận đó [18]. Đồng thời, các phân tử nước hay các phân tửđường trong hỗn hợp phản ứng có thể là chất ái nhân, để nhận gốc galactosyl từ phức enzyme-galactosyl [64]. Đây là sự xúc tác cho phản ứng thủy phân hay galactoyl hóa, phụ thuộc vào
http://www.ebook.edu.vn 35
nồng độ tương đối của các chất nhận có chức hydroxyl là nước hay carbohydrate [18,62]. Trong dung dịch lactose được làm loãng, nước nhiều hơn các đường khác như glucose, lactose, có thể cạnh tranh hơn để làm chất nhận, do đó, galactose được hình thành và đư ợc giải phóng từ trung tâm hoạt động. Nếu dung dịch có lượng lactose cao, phân tử lactose có nhiều cơ hội hơn để là chất nhận, nối với phức enzyme-galactosyl [38, 55] tạo ra trisaccharride. Trisaccharide có thể đóng
vai trò là chất nhận để tạo nên tetrasaccharide, pentrasaccharide hay
hexasaccharide [18, 21, 31, 72].
Hình 3.2. Cơ chế phản ứng galactosyl hóa [21].
Như vậy, β-galactosidase hoạt động xúc tác cho phản ứng thủy phân và phản ứng galactosyl hóa. Quá trình tổng hợp GOS có bản chất là quá trình galactosyl hóa [25]. Quá trình galactosyl hóa bao gồm phản ứng giữa các phân tử và phản ứng nội phân tử:
• Phản ứng nội phân tử là quá trình phức enzyme-galactosyl chuyển trực tiếp đến đồng phân vịtrí glucose được sinh ra từ lactose. Liên kết glycosidic của lactose [β- (1-4)] được tách ra và hình thành ngay lại ở vị trí khác của phân tửglucose trước khi nó khuếch tán ra khỏi trung tâm hoạt động. Đây là cách allolactose (β -(1-*6)