CHƯƠNG III SẢN PHẨM
3.1.2.2 Cách đếm Clostridium Perfringens [3] •Nguyên lý
Phương pháp này dựa vào đếm Clostridium Perfringens sử dụng kỹ thuật đổ đĩa và môi trường chọn lọc SPS. Clostridium Perfringens khử sulphite thành sulphide, chất này phản ứng với sắt trong môi trường hình thành tủa sắt đen làm cho khuẩn lạc Clostridium xuất hiện màu đen. Những khuẩn lạc này được làm test xác nhận. Kháng sinh ức chế tạp chất kỵ khí và kỵ khí tùy tiện.
• Môi trường và thuốc thử Môi trường làm giàu, thịt băm Môi trường thioglycolate lỏng
Môi trường peptone để pha loãng (0.1%) Canh thang sinh nha bào
Thạch SPS
Thuốc nhuộm Gram • Cách làm
Chuẩn bị đồng nhất mẫu thực phẩm Pha loãng
Nuôi cấy
- Lấy 1ml thực phẩm đồng nhất pha loãng cho vào đĩa petri đánh dấu, mỗi độ pha loãng dùng hai đĩa.
- Rót 15-20 ml thạch SPS vào mỗi đĩa, đảo đĩa cho thạch trộn đều với mẫu thực phẩm rồi để cho môi trường đông lại.
Ủ ấm :
Lật úp đĩa và để trong bình kỵ khí. Ủ ấm bình ở 35-370C trong 24h
Đếm khuẩn lạc ( nghi Clostridium Perfringens)
Chọn những đĩa có 30 – 300 khuẩn lạc, đếm số khuẩn lạc và tính số lượng trong 1g thực phẩm.
Xác nhận
Chọn 10 khuẩn lạc điển hình trên đĩa môi trường SPS cấy mỗi khuẩn lạc vào trong một ống canh thang thioglycolate vừa làm thoát khí và làm nguội.
Ủ ấm 350C trong 18 – 24h
- Xét nghiệm từng ống bằng nhuộm Gram và chọn canh khuẩn thuần khiết. Trực khuẩn Gram dương, mập , hai đầu tù.
- Nếu canh khuẩn đều thuần khiết cấy vào các ống môi trường nitrate di động, canh thang sinh nha bào và thịt băm. Ủ ấm 350C trong 24h
- Môi trường nitrat di động vi khuẩn mọc theo đường cấy (C.Perfringens không di động ) và khử nitrate bằng cách cho thêm 0.5ml dung dịch alpha- naphthyamine và một lượng tương tự acid sulphanilic (C.Perfringens hoàn nguyên nitrate, nghĩa là xuất hiện màu da cam trong vòng 5 phút)
Xét nghiệm canh thang nha bào: lấy cặn phết kính để khô, hơ lửa để cố định. Nhuộm
malachite green 10 phút rửa nước rồi nhuộm safranin trong vòng 15 giây, rửa, thấm, để khô và soi kính. Nha bào nhuộm màu xanh lá cây, tế bào sinh dưỡng bắt màu đỏ.
• Tính toán
Tính số C.Perfingens trong mẫu dựa vào tỷ lệ phần trăm những khuẩn lạc được làm test, xác nhận là C.Perfingens.