Các thí nghiệm trong phòng

3. ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG VÀ

3.4.3 Các thí nghiệm trong phòng

3.4.3.1 Phương pháp phân lập mẫu bệnh (Caten và Jinks, 1968).

Chuẩn bị mẫu bệnh : các mẫu bệnh thu ngoài đồng ruộng chọn những mẫu điển hình, mới, còn tươi, không dính thuốc bảo vệ thực vật phân lập ngay hoặc có thể đặt trong môi trường ẩm bão hoà với điều kiện nhiệt độ 16-180C trong vòng từ 12-24 tiếng để mô bệnh hồi phục và cành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh phát triển thành 1 lớp trắng xốp. Lúc này có thể kiểm tra xem có đúng là cành bào tử và bào tử phân sinh của P. infestans hay không. Chuẩn bị các vật liệu dùng trong phân lập :

- Nếu phân lập bằng khoai tây. Củ khoai tây sạch thuộc các giống nhiễm bệnh như Diamant được thu từ cây trồng trong nhà lưới hoặc các củ khoai tây thương phẩm sạch bệnh và không sử dụng các loại thuốc nội hấp chống bệnh mốc sương. Củ được rửa sạch đất trên bề mặt bằng nước máy, để ráo. Khử trùng bề mặt củ bằng Sodium hypochloride 1% trong 3 phút hoặc nhúng vào cồn 700 sau đó đốt trên ngọn lửa đèn cồn, chú ý khi đốt đảo đều tránh củ bị quá nóng gây chết mô. Các củ sau đó được cắt thành các lát có kích thước 5-7mm.

- Nếu phân lập bằng quả cà chua. Quả cà chua xanh, sạch bệnh thuộc các giống mẫn cảm như HT7, HT9 được thu từ những cây sạch bệnh trồng trong nhà lưới, hoặc cây sạch bệnh trên ruộng sản xuất không phun các loại thuốc nội hấp cũng như tiếp xúc để trừ bệnh mốc sương. Rửa sạch quả bằng nước máy, để ráo, khử trùng quả bằng Sodium hypochloride 1% trong 3 phút, để ráo. Cắt ngang quả thành những lát từ 5-7mm.

Phân lập : các mô bệnh được cắt thành các miếng nhỏ kích thước khoảng 1cm2 chứa ½ mô bệnh ½ mô khoẻ, nếu mô bệnh bị hoại sinh quá nhiều có thể lấy miếng to hơn nhưng khả năng tạp nhiễm nấm hoại sinh khác sẽ cao hơn. Các mảnh mô được khử trùng nhanh qua Sodium hypochloride 1% trong 3 phút hoặc bằng cồn 700 trong 1 phút, mảnh mô sau đó được nhúng qua nước cất vô trùng, để khô hoặc thấm nước bằng giấy thấm sạch.

Các mảnh mô bệnh sau đó được đặt úp xuống sau đó đặt một lát cà chua hoặc khoai tây đã được chuẩn bị như bước trên đậy nắp hộp petri. Chú ý không để lát khoai tây hoặc cà chua bị quá khô bề mặt vì có thể sẽ tạo ra lớp màng tế bào chết làm cho nấm không xâm nhập được. Các đĩa phân lập được đặt trong điều kiện 180C trong điều kiện tối hoàn toàn. Thường xuyên kiểm tra sự hình thành sợi nấm, cành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh ở mặt trên lát cắt khoai tây hay cà chua. Kiểm tra dưới kính lúp soi nổi, nếu đúng là

sợi hoặc cành bào tử phân sinh, bào tử phân sinh của nấm mốc sương thì dùng que cấy khêu nhẹ sợi nấm hoặc cành bào tử phân sinh đặt lên môi trường Pea-agar. Tuỳ thuộc vào giống khoai tây và cà chua mà thời gian xuất hiện sợi nấm, cành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh nhanh hay chậm, nếu thấy dấu hiện vùng đặt mô bệnh thâm đen thì có thể kết luận nấm đã xâm nhập vào mô thực vật.

Sau khi chuyển nấm trên môi trường 3-4 ngày kiểm tra sợi nấm có phát triển hay không, và nấm đã thuần hay chưa. Nếu mẫu đã thuần có thể cấy chuyển sau 7-9 ngày trên môi trường Pea (môi trường phát triển hệ sợi và bào tử vô tính) hoặc môi trường Rye để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.

3.4.3.2 Phương pháp điều chế môi trường.

3.4.3.2.1. Môi trường Pea-agar(Corbiere R. Andrivon D., 2000) Công thức nấu cho 1 lit môi trường.

Thành phần bao gồm:

+ Đậu Hà Lan : 125g + Agar: 15g

+ Nước cất: 1200ml

Cách điều chế môi trường: Cho 125g đậu + 1,2l nước cất vào nồi sạch. Đun sôi, sau đó nhỏ lửa trong vòng 45phút, lọc bằng vải lọc 4 lớp. Sau đó cho vào bình định mức 1l. Hoà tan 15g agar vào bình và hấp khử trùng ở 121°C, 1.5 atm trong 30 phút. Sau đó để nguội môi trường đến 60 - 70°C rồi đem đổ ra các đĩa peptri đã được khử trùng và sử dụng để cấy nấm.

3.4.3.2.2. Môi trường Rye A (Caten và Jinks) Cách nấu cho 1l môi trường:

1.Ngâm 60g hạt lúa mạch đen trong nước cất trong vòng 36 giờ.

2. Đổ nước ngâm rye trong bước 1 vào cốc đong và thêm vào 20g đường sucrose.

3. Đặt hạt rye đã được ngâm vào trong máy trộn và nhào trong vòng 10 giây

4. Đặt hạt vụn đã trộn ngâm trong nước 490 trong vòng 3 giờ.

5. Sau 3 giờ lọc lấy phần nước ngâm vắt kĩ phần hạt bằng vải lọc. Phần nước được thêm vào phần nước đã có ở bước 2.

6. Điều chỉnh pH bằng NaOH cho đến khi pH là 7 7. Thêm vào lượng nước cất cho vừa đủ 1l.

8. Thêm 15 g agar

9. Hấp tiệt trùng trong vòng 15 phút ở 1200C. 10. Để nguội tới 45-500C.

3.4.2.3.Môi trường Mix (Công thức nấu cho 1 lit môt trường)

50% môi trường Pea Agar + 50% môi trường Rye Agar, cả 2 loại như mô tả bên trên.

3.4.3.3 Phương pháp nhân nuôi nấm, thu bào tử phân sinh và đếm bào tử.

Phương pháp nhân nuôi nấm tạo bào tử phân sinh: Nhân nuôi nấm tạo bào tử phân sinh nhằm mục đích tạo ra một số lượng lớn bào tử để dùng trong các thí nghiệm về độc tính, kháng thuốc, khả năng tồn tại của bào tử trong ánh nắng trực xạ…. Có thể nhân nuôi nấm tạo bào tử phân sinh bằng những cách sau:

Nhân trên môi trường nhân tạo: Nấm được cấy trên môi trường Pea- agar, khi tản nấm mọc hết đĩa môi trường kiểm tra sự tồn tại của bào tử nấm.

Nhân trên lá cà chua, khoai tây: lá cà chua khoai tây thuộc các giống mẫn cảm sạch bệnh trồng trong nhà lưới cách ly. Các lá đơn sạch không bám đất, không quá già, úa được đặt úp mặt trên xuống trong các khay có lót giấy thấm đã thấm nước có thể phun trực tiếp dung dịch nước có chứa bào tử lên mặt dưới lá hoặc nhỏ các giọt bào tử lên mặt dưới lá. Bọc các khay lại để đảm bảo ẩm độ thích hợp để trong điều kiện 12 giờ sáng 12 giờ tối.

mốc sương, trồng trong nhà lưới hoặc củ thương phẩm (với điều kiện cây sạch bệnh và không phun các loại thuốc nội hấp trừ bệnh mốc sương) rửa sạch khử trùng bằng cách nhúng cồn sau đó đốt trên ngọn lửa. Củ khoai sạch được cắt thành từng khoanh xếp trong khay lót giấy thấm đã thấm nước, phun hoặc nhỏ trực tiếp dịch nước chứa bào tử lên trên, bọc kín khay để trong tối hoàn toàn.

Tất cả các phương pháp nhân nuôi nấm tạo bào tử đều được thực hiện trong tủ định ôn 180C.

Phương pháp thu bào tử: Các bào tử sau khi nhân nuôi có thể thu để tiếp tục tiến hành các thí nghiệm khác.

Thu bào tử nhân trên môi trường nhân tạo: Cho vào đĩa petri từ 1-3ml nước cất vô trùng dùng bàn trang thuỷ tinh di nhẹ trên bề mặt của môi trường nhân tạo cho bào tử rời ra khỏi sợi nấm sau đó chắt nước bào tử ra cốc hoặc bình định mức.

Thu bào tử nhân trên lá khoai tây, cà chua: lá đã nhiễm bệnh được bỏ vào túi nilon cùng với 10-20ml nước cất vô trùng tùy thuộc theo kích thước lá lắc đều, nếu lá còn nguyên nhặt lá bỏ ra ngoài chắt nước vào bình hay cốc đong, nếu lá bị nát có thể lọc qua vải màn để tránh các mô tế bào làm tắc bình phun hoặc làm sai lệch thể tích.

Thu bào tử trên khoanh củ: tương tự với trên lá nhưng khoanh củ chọn những khoanh khô không bị thối ướt, sau khi lắc đều nhặt bỏ các khoanh củ lọc dịch bào tử qua vải màn để loại bỏ các mảnh mô lớn.

Phương pháp nhân bào tử và thu bào tử trên môi trường nhân tạo cho kết quả tốt nhất về độ thuần cũng như độ sạch tuy vậy số lượng bào tử nhân lên không được nhiều.

Phương pháp đếm bào tử: Sử dụng phương pháp đếm trên lam kính Bucker có sẵn các ô đếm, đếm ngẫu nhiên theo một số ô. Mỗi ống eppendot được lắc mạnh cho bào tử phân bố đều trong ống, dùng pipet hút 10µl bào

tử rồi nhỏ lên trên lam kính. mỗi mẫu được đếm lại 2 lần.

3.4.3.4 Xác định chủng nấm của các isolate thu thập được.

Tất cả các isolate thu thập được đều được sử dụng trong thí nghiệm này. Sử dụng bào tử động của các isolate nấm, nhỏ 30μl nước chứa bào tử nấm chưa xác định chủng nấm lên mép lá cà chua hay khoai tây mép lá còn lại nhỏ 30μl nước chứa bào tử của A1 hoặc A2 nuôi cấy ở nhiệt độ 180C với điều kiện 12 giờ sáng 12 giờ tối. Quan sát sự hình thành bào tử trứng sau khi 2 vết bệnh đã đan xen vào nhau lắc đều lá cho tan trong cồn và kiểm tra dưới kính hiểm vi.

3.4.3.5 Ảnh hưởng của ánh sáng trực xạ tới khả năng tồn tại nảy mầm của bào tử mốc sương.

Thử khả năng nảy mầm của bào tử nấm P. infestans sau khi tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng trực xạ hay được che bóng.

Bào tử mốc sương thu được từ các lá khoai tây hay cà chua được nhiễm bệnh nhân tạo trước đó 7 ngày. Thí nghiệm bao gồm 3 công thức lớn :

+ Đặt dưới ánh nắng trực xạ + Đặt dưới mái che

+ Đặt trong điều kiện tối thích (đối chứng)

* Thí nghiệm xác định khả năng nảy mầm của bào tử sau các khoảng thời gian 0,60,120 phút với 3 công thức trên.Thí nghiệm này được tiến hành vào các mốc thời gian : 9-11am,10-12 am, 11-13am, 12-14pm trong cùng ngày. Thí nghiệm được tiến hành trong 2 kiểu thời tiết ngày nắng(600W/m2) và ngày mù Chỉ tiêu theo dõi là ti lệ số bào tử nảy mầm trên môi trường nhân tạo (đếm đại diện 300 bào tử) ghi nhận số bào tử nảy mầm và không nảy mầm ở mỗi thí nghiệm.

* Thí nghiệm xác định khả năng nảy mầm của bào tử nấm mốc sương sau khoảng thời gian 0,10,20, 30,40,50,60 phút với mốc thời gian 12-13 giờ trong điều kiện ngày nắng và ngày có mây.

Chỉ tiêu theo dõi là tỉ lệ nảy mầm của bào tử nấm trên môi trường nhân tạo.

3.4.3.6 Phương pháp nghiên cứu thời gian tiềm dục của bệnh trên một số giống cà chua, khoai tây

Lá chét cà chua hoặc khoai tây lá đơn được đặt úp để lên đĩa peptri sạch, trong đĩa có 1 lớp giấy lọc ẩm với 5ml nước cất, nhắc lại 10 lần với 5 lá cà chua và 5 lá khoai tây/1 isolate/1giống.

Thí nghiệm tiến hành trên 10 giống cà chua (Money maker, Santa clara, UC 82b, TL 10, T620, TL 19, T6, Rachal, VL 2500, CNL) và 6 giống khoai tây (Diamant, Solara, PO3, Taurus, Atlantic, TFL 1867) giống khoai tây đối với các mẫu bệnh mix 1, mix2, mix 3, tom 09.

Pha dung dịch bào tử đã nhân nuôi ở nồng độ 104 bào tử/ml lây nhiễm bào tử bằng cách nhỏ 10µl (100 bào tử/ lá) vào chính giữa.

Sau đó đặt trong tủ định ôn ở điều kiện 12h sáng/tối và 180C. Quan sát sự hình thành bào tử, cành bào tử và sợi nấm. Mỗi ngày quan sát 2 lần cách nhau 12 giờ.

Chỉ tiêu theo dõi : thời gian xuất hiện bào tử của các isolate khác nhau trên các giống khoai tây, cà chua khác nhau.

3.4.3.7 Phương pháp nghiên cứu tốc độ phát triển của vết bệnh

Sau mỗi 24h quan sát sự lan rộng của cành bào tử phân sinh và bào tử trên các lá chét trong thí nghiệm đã nêu ở mục 3.4.3.6. Đo đường kính bào tử nấm phát triển bằng thước đo mm. Sử dụng các ký hiệu khác nhau cho từng ngày đo để biết được sự phát triển của tản nấm.

Chỉ tiêu theo dõi : kích thước của vết bệnh trong mỗi ngày cho tới ngày thứ 7 sau lây nhiễm, từ đó tính tốc độ phát triển vết bệnh theo chỉ tiêu RAUDPC.

3.4.3.8 Khả năng hình thành bào tử và số lượng bào tử hình thành trên mỗi vết bệnh

Sau 7 ngày từ khi lây nhiễm như trong thí nghiệm mục 3.4.3.6, xác định được số lượng bào tử trên mỗi lá đã lây bệnh bằng phương pháp thu đếm bào từ như đã mô tả trong phương pháp đếm bào tử. Nếu không cần bào tử để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo có thể thay nước bằng cồn 900.

3.4.3.9 Phương pháp nghiên cứu khả năng lây nhiễm của bào tử nấm

Các lá được chọn ngẫu nhiên từ nhà lưới đục thành khoanh tròn có đường kính 14mm, đặt 10 khoanh/1 đĩa có giấy thấm nước cất (3,5ml).

Bào tử được pha loãng 5 lần, qua 4 bước với nồng độ bào tử ban đầu là 104. Nhỏ vào mỗi khoanh lá 10µl vào chính giữa.

Các bước pha loãng lần lượt giảm dần theo các mức: 100 - 25 - 6,2 -1,6 - 0,4 bào tử/ khoanh lá.

Đặt trong phòng lạnh ở t0 18°C (12h sáng, 12h tối).

Sử dụng 10 giống cà chua (Money maker, Santa clara, UC 82b, TL 10, T620, TL 19, T6, Rachal, VL 2500, CNL) và 6 giống khoai tây (Diamant, Solara, PO3, Taurus, Atlantic, TFL 1867) giống khoai tây đối với các mẫu bệnh mix 1, mix2, mix 3, tom 09.

Chỉ tiêu theo dõi: số khoanh lá xuất hiện bào tử ở mỗi nồng độ bào tử, trên mỗi giống của từng isolate sử dụng.

3.4.3.10 Phương pháp nghiên cứu khả năng tồn tại của bào tử mốc sương trong đất canh tác (Lancey, 1965)

Đất được được sử dụng trong thí nghiệm là đất trồng lúa và đất trồng màu. Đất được khử trùng hoặc để tự nhiên.

Đất khử trùng bằng nồi hấp ở điều kiện 1210C trong 15 phút. Đất tự nhiên và đã khử trùng được đập mịn rây bỏ các hạt sạn, sỏi…

Nguồn nấm thử nghiệm gồm tổng hợp các nguồn nấm thu được trên khoai tây và nguồn nấm thu được trên cà chua.

Nấm sau khi được nhân nguồn phun vào đất thí nghiệm với nồng độ 10000 bào tử/ml.

Sau 0, 7, 14, 21,...ngày với khoảng cách giữa các lần là 7 ngày lấy 1ml đất từ các công thức thí nghiệm trải đều trên khoanh khoai tây giống nhiễm đã khử trùng bề mặt củ có thể cho thêm nước cất nếu thấy bề mặt khô. Sau 1 ngày cắt lát khoai tây thành 8 miếng tương đối bằng nhau, đặt trong khay nhựa các miếng cắt không chạm vào nhau. Sau 7 ngày quan sát dưới kính soi nổi sự hình thành của cành bào tử phân sinh, bào tử phân sinh.

Chỉ tiêu theo dõi: số mảnh củ bị bệnh sau các mốc thời gian.

3.4.3.11 Phương pháp nghiên cứu thành phần nấm hại trên củ khoai tây giống và thương phẩm.

Củ khoai tây thuộc các giống : Diamant, Belarosa, Solara, Marlan, Provento, Esprit, Jerry, Sinora, Marabel, Atlantic được sử dụng trong thí nghiệm.

Dùng kính soi nổi quan sát bề mặt của củ khoai tây giống và thương phẩm, xác định và phân lập các nấm xuất hiện trên củ.

Củ khoai tây được rửa qua, để ráo nước tiến hành đục lấy mắt củ với đường kính 14mm, mỗi củ lấy 3 mắt, đặt 12 khoanh/1 đĩa, mỗi giống được lặp lại 3 lần.

Chỉ tiêu theo dõi: thành phần nấm, bệnh hại củ khoai thương phẩm hoặc khoai giống, trên toàn củ và mắt củ.

3.4.3.12 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản tới thành phần nấm hại trên mắt củ khoai tây giống.

Thí nghiệm được tiến hành ở các điều kiện bảo quản khác nhau: nhiệt độ phòng, 180C, 40C với các đối tượng là nấm Fusarium oxysporum,

Rhizoctonia solani, Helminthosporium solani gây hại trên mắt củ của 10 giống

khoai tây : Diamant, Belarosa, Solara, Marlan, Provento, Esprit, Jerry, Sinora, Marabel, Atlantic

3.4.3.13 Phương pháp nghiên cứu tính kháng Metalaxyl và Metalaxyl M của nấm P. infestans

3.4.3.13.1 Xác định tính kháng thuốc trên khoanh củ

Các khoanh củ được đặt trong các đĩa petri chứa một lượng nước có nồng độ thuốc là 100μg/ml. Nồng độ bào tử sử dụng là 500 bào tử, 5000 bào tử, 104, 2x104, 8x104 bào tử/ml. Bào tử nấm P. infestans đã được đặt trong điều kiện 4-80C trong vòng 2.5 giờ để sản sinh bào tử động. Lây nhiễm 10μl