V. ỨNG DỤNG CỦA VIỆC NUƠI CẤY NGUYÊN BÀO SỢI
V.4ỨNG DỤNG TRONG CHỌN GIỐNG VẬT NUƠI
− Sử dụng phương pháp chọn giống vật nuơi thơng qua phương pháp nhân bản vơ tính động vật, sử dụng nguyên bào sợi như là nguồn tế bào dùng để cho nhân, dùng để tạo dịng động vật mục tiêu mong muốn.
PHẦN III : PHƯƠNG PHÁP
III.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Trong thí nghiệm này, mẫu chúng tơi dùng là mơ gai nhau được lấy từ hai nguồn mẫu khác nhau :
+ Mẫu mơ nhau được lấy thơng qua việc mổ nọi soi ở những người được chẩn đốn là thai ngồi tử cung, mẫu mơ nhau là mơ non chưa đủ tháng nằm trong tai vịi, được thu nhận vơ trùng.
+ Mẫu mơ nhau là múi nhau được lấy từ những sản phụ đủ tháng sanh qua đường mổ. Mẫu mơ nhau là nhau đủ tháng được thu nhận một cách vơ trùng.
Mẫu được cung cấp bởi Bệnh viện Từ Dũ.
III.1 CÁC MỤC TIÊU CẦN ĐƯỢC KHẢO SÁT
- Xác định phương pháp nuơi tối ưu cho sự phát triển của nguyên bào sợi từ mẫu mơ nhau.
- Dựa vào kết quả trên, dùng phương pháp nuơi tối ưu để tiến hành nuơi nguyên bào sợi từ mẫu mơ nhau để đạt được mật độ cần thiết cấy chuyền trên bốn loại mơi trường AMNIOMAX, DMEM, EMEM, AMNIOMAX + EMEM (tỉ lệ 1:1, v/v).
- Đánh giá sự phát triển của nguyên bào sợi trên bốn loại mơi trường bằng việc quan sát sự phát triển của tế bào (ghi nhận ảnh) và đi xác định mật độ tế bào theo các khoảng thời gian nuơi (0h – 120h nuơi) trên quang trường 20X.
- Đưa ra kết luận về mơi trường tối ưu và phương pháp nuơi hiệu quả cho mẫu mơ gai nhau.
III.2 TRÌNH TỰ THÍ NGHIỆM
Bước 1 : Thu nhận mẫu và ghi nhận các thơng tin liên quan đến mẫu mơ. Các thơng tin này bao gồm :
- Thời gian lấy mẫu (ngày giờ)
- Thời gian tiến hành thao tác tại phịng thí nghiệm - Thời gian kết thúc thí nghiệm
Bước 2 : Tiến hành chiếu UV khử trùng tủ cấy, dụng cụ và hĩa chất.
Bước 3 : Tiến hành xử lý mẫu
Bước 4 : Thu nhận mơ mục tiêu, cắt nhỏ và tiến hành xử lý tiếp theo các phương pháp nuơi khác nhau.
Bước 5 : Tiến hành nuơi tế bào trong tủ ấm CO2 ở 36,5 0C, 5% CO2, 95% khơng khí.
Bước 6 : Quan sát mẫu theo các khoảng thời gian từ 0h nuơi – 120h nuơi. Ghi nhận kết qủa bằng hình ảnh và tiến hành đếm mật độ tế bào trên quang trường 20X.
Bước 7 : Kiểm tra, đánh giá dữ liệu thu nhận.
III.3.1 VƠ TRÙNG DỤNG CỤ VÀ HỐ CHẤT A. DỤNG CỤ
Dụng cụ bằng thủy tinh và kim loại được vơ trùng bằng cách hấp khử trùng hơi nước với autoclave (121oC ở 1atm trong 30 phút)
Dụng cụ nhựa : lau bằng cồn 700, để khơ tự nhiên và chiếu UV 30 phút trước khi sử dụng.
B. HĨA CHẤT
PBS, nước cất : hấp khử trùng hơi nước
Enzyme Trypsin : vơ trùng bằng cách lọc qua màng lọc micro filter cĩ đường kính 0.2µm
III.3.2 VƠ TRÙNG NƠI TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM A. VƠ TRÙNG KHU VỰC THAO TÁC
- Tiến hành lao cồn bề mặt làm việc của tủ cấy và chiếu UV khử trùng tủ cấy
- Đặt dụng cụ thao tác thí nghiệm như : đèn cồn (đã khử trùng xung quanh bề mặt bằng cồn), dụng cụ thí nghiệm, hĩa chất (hấp khử trùng hoặc lọc nếu cần theo quy trình pha chế) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Chiếu khử trùng UV tủ cấy một lần nữa sau khi đã đặt các dụng cụ, hĩa chất .v.v..
B. VƠ TRÙNG ĐỒ BẢO HỘ THÍ NGHIỆM
Quần áo, Khẩu trang, Nĩn, Găng tay vơ trùng bằng cách hấp khử trùng hơi nước với autoclave (121oC ở 1atm trong 30 phút).
III.3.3CÁC QUY TRÌNH SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM III.3.3.1 THU NHẬN VÀ XỬ LÝ MẪU
Bánh nhau sau khi được lấy ra ngồi qua đường mổ được lấy vơ trùng dù mẫu lấy từ đường sanh mổ ở nhau đủ tháng hoặc mổ nọi soi từ thai ngồi tử cung cho vào chai đựng mơi trường ( sử dụng mơi trường EMEM để giữ mẫu sau khi lấy từ phịng mổ ở Bệnh viện Từ Dũ đưa về phịng thí nghiệm Vật liệu Sinh học, Khoa Mơ phơi – Giải phẫu bệnh)
Mơ nhau sau đĩ được cho vào đĩa petri sạch, vơ trùng (vt) và rửa với PBSA sạch (vt) 3 lần để làm sạch mẫu.
Mơ nhau sau đĩ được chuyển sang đĩa petri mới (vt) để tiến hành các thao tác tiếp theo.
III.3.3.2 PHÂN LẬP VÀ TÁCH KHỐI MƠ
Sử dụng pince và kéo để cắt bỏ lớp mơ bao bên ngồi gai nhau. Sau đĩ, chuyển khối tế bào bên trong này sang đĩa petri mới (vt) và dùng PBSA sạch (vt) rửa mẫu cho sạch.
Cắt mẫu mơ thành từng khối, chọn các khối mơ bao xung quanh mạch máu. Dùng pince bĩc tách các khối mơ này và chuyển sang đĩa petri mới (vt). Dùng PBSA sạch (vt) rửa các khối mơ này. Rửa lại các mảnh mơ này với PBSA (vt) cho đến khi các khối mơ này trở nên trong. Chuyển các khối mơ này sang đĩa petri mới (vt) và cắt thành những khối nhỏ đường kính 1mm3. Giữ lại phần dịch rửa cuối cùng này để làm nguyên liệu cho các bước thí nghiệm tiếp theo.
A. NUƠI SƠ CẤP
Dùng pipette thủy tinh (đã hấp khử trùng) hút lấy các khối mơ nhỏ đường kính 1mm3 cho vào ống ly tâm vơ trùng (loại 15 hoặc 50 ml), rửa lại bằng PBSA (vt) 2 – 3 lần. Sau đĩ để lắng.
Dùng pipette thủy tinh hút lấy các khối mơ sau lần rửa cuối cùng cho vào chai nuơi (chai nuơi (khoảng 20 – 30 mẫu mơ / một chai cấy 25cm2).
Dùng pipette thủy tinh loại bỏ dịch rửa PBSA trong chai nuơi và sau đĩ thêm một lớp mỏng mơi trường (1ml mơi trường cho chai 25cm2)
Sau đĩ đặt chai nuơi thẳng đứng trong tủ nuơi ở 36,50C, 5% CO2, cho đến khi các mẫu mơ bám dính. Khi các mẫu mơ đã bám dính vào chai nuơi thì tiến hành thay mơi trường mới và để chai nuơi nằm ngang bình thường.
Quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược và ghi nhận kết quả.
B. NUƠI PHẦN CẶN TẾ BÀO
Dùng pipetteman (20 – 1000ml) hút lấy phần dịch cặn của lần rửa mơ cuối cùng bằng dung dịch PBSA sạch (vt) cho vào ống ly tâm.
Đem ly tâm với tốc độ 1000 vịng/phút trong 10 phút.
Dùng pipetteman loại bỏ phần dịch nổi và huyền phù với 1ml mơi trường nuơi (huyền phù tế bào bằng vortex)
Sau đĩ cho phần huyền phù tế bào này vào chai nuơi và bổ sung mơi trường nuơi theo tỉ lệ : dịch huyền phù tế bào : mơi trường nuơi (1:4).
Đặt chai nuơi vào trong tủ nuơi ở 370C, 5% CO2.
C. NUƠI PHẦN MƠ SAU KHI ĐÃ TÁCH BẰNG QUY TRÌNH TRYPSYN ẤM
1. Dùng pince chuyển các mẫu mơ cịn lại vào erlen loại 50ml đã chứa sẵn PBS (nếu khơng các mảnh mơ sẽ dính vào thành erlen và pince). Rửa lại các mảnh mơ trong PBS để mơ được ổn định, sau đĩ loại bỏ phần dịch trong bên trên đi. Lặp lại quá trình rửa mơ này 2 – 3 lần.
2. Sau khi rửa sạch mẫu (loại bỏ phần PBS rửa mẫu lần cuối), thêm dung dịch trypsin 0.25% (1 ml trypsin 0.25% cho mỗi 100mg mơ ) vào erlen.
3. Khuấy từ gia nhiệt với tốc độ 150 – 200 vịng/phút, nhiệt độ 36.5 0C, thời gian 30 phút.
4. Sau thời gian trên, để mẫu ổn định lại và thu lấy phần dịch trong đem ly tâm với tốc độ khoảng 1000 vịng/phút trong 10 phút.
5. Hút bỏ dịch trong bên trên, thêm 1ml mơi trường nuơi vào và huyền phù phần cặn tế bào để tạo thành dịch huyền phù tế bào. Đi xác định mật độ tế bào/ml bằng buồng đếm Neubauer.
6. Chuyển 1ml dịch tế bào huyền phù với mật độ tế bào ban đầu và bổ sung 4ml mơi trường nuơi mới vào chai nuơi.
7. Đặt chai nuơi vào trong tủ nuơi ở 370C, 5% CO2, 95% khơng khí. Quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược và ghi nhận kết qủa. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
III.3.3.4 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MẬT ĐỘ TẾ BÀO BẰNG BUỒNG
ĐẾM NEUBAUER
Các thao tác sử dụng buồng đếm
- Rửa sạch buồng đếm và lamelle bằng cồn
- Đặt buồng đếm lên kính hiển vi, quan sát và chỉnh kính ở vật kính ×40 - Nhỏ một giọt dịch tế bào lên buồng đếm
- Đếm tế bào theo phương pháp đếm tế bào hồng cầu cơng thức tính mật độ tế bào
- Một buồng đếm cĩ 25 ơ lớn. Mỗi ơ lớn cĩ 16 ơ nhỏ. Vậy 1 buồng đếm cĩ 25×16 = 400 ơ nhỏ
- Sau khi đếm tế bào ở 5 ơ lớn (đếm ở 4 gĩc và ở trung tâm của buồng đếm) đem chia cho 5 => tổng số tế bào thu được là A
- Thể tích 1 ơ nhỏ là:1/20×1/20×1/10 =1/4000mm3 - Thể tích của buồng đếm là :400×1/4000 = 1/10 mm3 - Số tế bào trong một ml mơi trường là (S):
- S = A×10×100×103 = A×106(tb/ml)
III.3.3.5 PHƯƠNG PHÁP THAY MƠI TRƯỜNG
Chai nuơi sau khi đã cĩ tế bào mọc và phát triển, để duy trì sự phát triển của tế bào cần phải tiến hành thay mơi trường mới để bổ sung nguồn dinh dưỡng và các yếu tố cần thiết cho tế bào phát triển.
Dùng ống tiêm mới (vt) hút bỏ dịch mơi trường củ (cẩn thận nghiêng chai nuơi nằm nghiêng về phía người thao tác để hút hết dịch mơi củ trong chai và để tránh hút phải tế bào đang bám phát triển)
Dùng ống tiêm mới khác (vt) để hút mơi trường mới và bổ sung vào chai nuơi (cẩn thận nghiêng chai nuơi về phía người thao tác và bơm mơi trường lên thành chai nuơi, tránh bơm trực tiếp vào bề mặt chai nuơi vì cĩ thể làm tổn thương tế bào đang phát triển và làm tế bào tách khỏi bề mặt chai nuơi).
III.3.3.6 CẤY CHUYỀN TẾ BÀO
1. Đổ bỏ mơi trường củ trong chai nuơi (bình roux) cĩ tế bào đang phát triển đạt đến mật độ cần thiết đủ để cấy chuyền (khoảng 70 – 80% diện tích chai nuơi) vào bercher vơ trùng đựng nước bỏ.
2. Dùng pipette hút 2ml PBS(-) sạch (vt) cho vào chai nuơi, lắc nhẹ để rửa sạch tế bào chết và huyết thanh, đổ bỏ PBS (-), lặp lại hai lần.
3. Dùng pipette khác hút 2ml trypsin cho vào chai nuơi.
4. Để chai nuơi trong lịng bàn tay, lắc nhẹ qua lại khoảng 50 lần (chú ý khơng để nắp chai nuơi chạm tay).
5. Đổ bỏ trypsin, cầm chai nuơi bằng tay phải vỗ nhẹ vào lịng bàn tay trái để tế bào tách khỏi vách chai nuơi.
6. Hút 3ml mơi trường AMNIOMAX cho vào chai nuơi, tráng đều lên bề mặt chai nuơi cĩ tế bào.
7. Hút vào mỗi chai nuơi mới 5ml mơi trường lần lượt là AMNIOMAX, DMEM, EMEM, AMNIOMAX+EMEM (tỉ lệ 1:1,v/v).
8. Dùng pipette 1ml gắn vào bĩp cao su (loại nhỏ) hút sục mơi trường phun đều vào bề mặt chai nuơi cĩ tế bào để huyền phù tế bào.
9. Cho vào mỗi chai nuơi mới đã bổ sung sẵn mơi trường nuơi 0.5ml dịch huyền phù tế bào. Lắc nhẹ, ủ ở 370C, 5%CO2 trong tủ nuơi.
Sau 24 giờ nuơi bắt đầu quan sát và ghi nhận kết quả.
III.3.3.7 CÁCH ĐẾM TẾ BÀO TRÊN QUANG TRƯỜNG 20X
1. Chọn năm điểm trên chai nuơi, đánh số thứ tự 1, 2, 3, 4, 5 (năm điểm này phân bố đều trên bề mặt chai nuơi tương tự với cách đếm tế bào trên buồng đếm Neubauer : bốn ơ ở bốn gĩc và một ơ ở giữa chai nuơi.
2. Đếm số tế bào cĩ mặt lần lượt trên năm vị trí đã chọn trên quang trường 20X. 3. Lấy giá trị trung bình của số tế bào đếm được trên năm ơ => mật độ tế bào trên
một quang trường 20X.
III.3.4 DỤNG CỤ – THIẾT BỊ – HĨA CHẤT III.3.4.1 DỤNG CỤ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Đĩa petri (đường kính 10 cm) - Erlen 50ml - Đèn cồn - Becher 50ml, 100ml, 250ml - Pipetteman (20 – 1000ml) - Ống đong 500ml - Kẹp cong và thẳng - Kéo cong và thẳng - Đầu type 100 – 1000 ml - Buồng đếm NEUBAUER - Lamelle - Gịn thấm và khơng thấm
− Màng lọc micro filter cĩ đường kính 0.2µm - Bình xịt cồn
- Oáng ly tâm 15ml
- Oáng tiêm và kim tiêm (Vinahankook Disposable Syringe) loại 5ml/CC và 10ml/CC. Được vơ trùng bằng E.O.GAS
III.3.4.2 THIẾT BỊ
- Tủ cấy vơ trùng, Clyde-Apae - Tủ ấm, Heraeus
- Nồi hấp vơ trùng, SANYO Labo Autoclave, SANYO Electric Co.,LTD - Máy ly tâm, H-12A, No. 93481, KOKUSAN ENSENKI Co.,LTD - Máy ảnh, Olympus
- Máy khuấy từ gia nhiệt - Tủ sấy,
- Tủ lạnh, SANYO SR-9R Basic & high quality - Kính hiển vi quang học, Olympus
- Kính hiển vi quang sát đơi Leica
III.3.4.3 HĨA CHẤT
- Dung dịch PBSA (khơng chứa ion Ca2+ và Mg2+)
Thành phần Hàm lượng NaCl 5g KCL 0.125g Na2HPO4 1.803g KH2PO4 0.125g H2O cất vừa đủ 500ml pH 7,2
Khơng bổ sung kháng sing Penicillin và Streptomycin 200X sau khi pha hồn tất dung dịch PBSA.
Trypsin (nồng độ 25%)
Lọc vơ trùng bằng màng lọc minipore filter cĩ đường kính lổ 0.45 – 0.22 µm Bảo quản lạnh ở 40C
Cồn (700 – 900) và một số hĩa chất thơng thường khác.
III.3.4.4 MƠI TRƯỜNG
− AmnioMAX™-C100 Basal Medium, với L-Glutamine (Cat. No. 17001 – 082, Lot No 1145148, 90 ml) cĩ bổ sung AmnioMAX™-C100 Supplement (Cat. No. 12556- 015, 15 ml)
− DULBECCO’S MODIFIED EAGLE’S MEDIUM (với L-Glutamine và 1000 mg Glucose/L, khơng cĩ Phenol Red và Sodium Bicarbonate) Product Number : D – 2902. Bổ sung 20% huyết thanh.
− Minimum Essential Medium (MEM) (1X) liquid (chứa Hank's salts và L- glutamine, 500ml), Catalog Number: 21575 – 022, Lot No 3073244. Bổ sung 20% huyết thanh
PHẦN IV: KẾT QUẢ
IV.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA NGUYÊN BÀO SỢI TỪ MƠ NHAU
IV.1.1 KẾT QỦA QUAN SÁT MẪU MƠ NHAU THU NHẬN TỪ MỔ NỌI SOI Ở TAY VỊI
Quan sát sau khi nuơi ba chai nuơi trên cùng một mơi trường (AMNIOMAX) theo ba phương pháp nuơi khác nhau thì trên cả ba chai nuơi đều khơng cĩ dịng nguyên bào sợi từ mẫu mơ nhau mục tiêu mọc.
Thí nghiệm được lặp lại một lần nữa, khơng cĩ sự thay đổi về phương pháp cũng như nguồn mẫu nhưng kết quả vẫn khơng cĩ nguyên bào sợi mọc từ mẫu mơ nhau này.
IV.1.2 KẾT QỦA QUAN SÁT MẪU MƠ NHAU THU NHẬN QUA ĐƯỜNG SANH MỔ Ở NHAU ĐỦ THÁNG
Cả ba phương pháp nuơi đều cĩ nguyên bào sợi mọc :
− Chai nuơi nguyên phát cĩ các mẫu mơ bám dính và nguyên bào sợi lan toả từ các mảnh mơ này, cĩ một số nguyên bào sợi rời mọc rải rác.
Hình 21 : sự phát triển của nguyên bào sợi sau 24h nuơi từ mẫu mơ nuơi nguyên phát (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
− Chai nuơi phần cặn tế bào sau ly tâm cĩ các nguyên bào sợi rời mọc rải rác tạo thành cụm trong chai nuơi.
− Trong chai nuơi từ mẫu mơ sau khi tách bằng trypsin cĩ sự xuất hiện của nguyên bào sợi sau 24h nuơi. Nguyên bào sợi mọc nhiều và đạt đến mật độ tế bào cần cấy chuyền ( chiếm khoảng 70 – 80% diện tích chai nuơi) sau một tuần nuơi.
Hình 22 : các nguyên bào sợi mọc xung quanh mẫu mơ được nuơi nguyên phát
Hình 23 : Sự phát triển thành cụm của nguyên bào sợi từ phần cặn tế bào sau khi ly tâm (10X)
Hình 24 : Sự phát triển của nguyên bào sợi sau 24h nuơi (1 ngày). 20X
Hình 25 : Sự phát triển của nguyên bào sợi sau 96h nuơi (4 ngày nuơi). 20X
IV.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG CỦA NGUYÊN BÀO SỢI THU NHẬN TỪ MẪU MƠ NHAU SỔ TRÊN CÁC LOẠI MƠI TRƯỜNG KHÁC NHAU.
Sau khi mẫu nuơi trên mơi trường AMNIOMAX đã phát triển đến mật độ cần thiết để cấy chuyền. Để so sánh sự khác nhau giữa các mơi trường nuơi dựa vào khả năng phát triển của nguyên bào trên các loại mơi trường này. Chúng tơi đã tiến hành cấy chuyền mẫu chai nuơi cấy bằng phương pháp trypsin ấm được nuơi trên mơi trường AMNIOMAX sang bốn loại mơi trường : AMNIOMAX, DMEM (cĩ bổ sung 20% huyết thanh), EMEM (cĩ bổ sung 20% huyết thanh), AMNIOMAX + EMEM (theo tỉ lệ 1:1). Kết quả sẽ được khảo sát trong vịng 120h nuơi (5 ngày ) kểt từ ngày bắt đầu cấy chuyền sang mơi trường mới. Kết quả được đánh giá thơng qua việc ghi nhận hình ảnh sự phát triển của nguyên bào sợi (cách nhau 24h nuơi) và đi xác định mật độ tế bào phát triển trên chai nuơi thơng qua việc đếm số tế bào/ quang trường 20X.
IV.2.1 KẾT QUẢ
IV.2.1.1 NGÀY THỨ NHẤT (24h nuơi)
Bảng kết quả:
MƠI TRƯỜNG/
QUANG TRƯỜNG (20X) AMNIOMAX DMEM EMEM
AMNIOMAX +EMEM 1 49 0 23 36 2 12 0 12 10 3 33 1 21 20 4 68 1 25 16 5 30 0 34 32 MẬT ĐỘ TẾ BÀO (TB) TRUNG BÌNH/ QUANG TRƯỜNG 20X 38.4 0.4 23 23.8