III.1 GIÁ THỂ
Phần lớn tế bào động vật cĩ xương sống được nuơi in vitro tăng trưởng như một lớp đơn trên bề mặt nhân tạo. Từ những cố gắng sớm nhất, thủy tinh đã được sử dụng như là giá thể, khởi đầu do đặc tính quang học của nĩ, nhưng do tế bào cần dàn trãi lên trên một bề mặt giá thể thích hợp cho sự tăng trưởng [27,28,40] để khắc phục tình trạng này sau đĩ người ta đã dùng nhựa plastic do chúng cĩ đặc tính quang học tốt và bề mặt tăng trưởng bằng phẳng, tạo ra được bề mặt tăng trưởng tốt và cĩ thể tái sử dụng trong nuơi cấy.
Hiện nay đa số người ta thích dùng polystyrene. Ngồi ra cịn cĩ các loại giá thề bán thấm, các loại vi giá thể và giá thể nhân tạo khác.
Sự lựa chọn giá thể được quyết định dựa vào:
− Khả năng sinh sản của tế bào.
− Sự tăng của tế bào trong dịch treo hoặc tạo lớp đơn.
− Việc nuơi nên để thơng khí hay bịt kín.
− Mẫu chuẩn và mẫu thí nghiệm được thực hiện hay khơng.
− Giá cả cĩ hợp lý.
III.2 PHA KHÍ III.2.1 OXYGEN
Phần quan trọng trong cấu tạo của pha khí là Oxy và CO2. Áp lực Oxy phù hợp với hầu hết các loại tế bào nuơi, đặc biệt là giai đoạn muộn của phơi, cá thể mới sinh hoặc trưởng thành cần đến 95% Oxy trong pha khí.
Chiều sâu của mơi trường nuơi cĩ thể ảnh hưởng đến tỉ lệ khuyếch tán Oxy hồ tan của tế bào, thích hợp nhất nên giữ độ sâu của mơi trường trong khoảng 2-5mm.
III.2.2 CO2
CO2 cĩ nhiều vai trị quan trọng như : ảnh hưởng đến nồng độ CO2 hồ tan, pH và nồng độ HCO3-. Rất khĩ khăn để xác định chính xác áp lực CO2 khơng khí để kiểm sốt nồng độ CO2 hồ tan.
Đây là một phản ứng thuận nghịch diễn ra:
H2O + CO2 ⇔ H2CO3⇔ H+ + HCO3- (1)
Kết quả của việc gia tăng CO2 khơng khí là làm giảm pH. Vì thế, hiệu quả của việc gia tăng áp lực CO2 được trung hồ bởi sự gia tăng nồng độ bicarbonate.
NaHCO3⇔ Na+ + HCO3- (2)
Sự gia tăng HCO3- làm cân bằng (1) cho đến khi cĩ sự cân bằng pH ở 7.4 NaOH + H2CO3⇔ NaHCO3 + H2O ⇔ Na+ + HCO3- + H2O (3)
Hầu hết việc nuơi cấy trong điều kiện in vitro, áp lực CO2 được nhiều nhà nghiên cứu chấp nhận là 5% CO2 trong 95% khơng khí.
Aûnh hưởng của mơi trường trên nuơi cấy tế bào biểu hiện qua 4 con đường : 1 Tính tự nhiên của giá thể hoặc các phương pháp nuơi cấy khác nhau. 2 Sự cấu thành của các yếu tố lý hố và sinh lý của mơi trường.
3 Thiết lập về giai đoạn pha khí. 4. Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ.
Sự lựa chọn một mơi trường dinh dưỡng bị ảnh hưởng lớn bởi: 1. Kiểu tế bào
2. Kiểu nuơi (lớp đơn, dịch treo, tạo dịng)
3. Tuỳ thuộc vào lượng hĩa chất xác định cần thiết
Sự hư hỏng của mơi trường bột cĩ lẽ được nhận diện bởi một vài hoặc tất cả các yếu tố sau:
1. Sự thay đổi màu sắc 2. Sự tạo hột/ kết thành cục 3. Sự khơng hịa tan được
Sự hư hỏng của mơi trường lỏng cĩ lẽ được nhận diện bởi một vài hoặc tất cả các yếu tố sau :
1. Sự thay đổi pH
2. Cĩ chất kết tủa hoặc cĩ vật gì đặc biệt cĩ mặt ở khắp mọi nơi trong mơi trường.
3. Sự xuất hiện của màu đục 4. Sự thay đổi màu sắc
Việc nuơi tế bào bắt đầu từ nuơi nguyên phát với các mảnh mơ cĩ thể tăng sinh in vitro và được cấy chuyền dẫn đến việc thử nghiệm tạo ra nhiều loại mơi trường hơn để duy trì sự tăng trưởng của dịng tế bào liên tục và thay thế mơi trường tự nhiên như : dịch chiết phơi, dịch thuỷ phân protein, lymph v.v.
Sự tiếp cận để phát triển một mơi trường mới thường bắt đầu với một mơi trường giàu chất dinh dưỡng như :
Ham’s F12 hoặc mơi trường 199 được bổ sung với nồng độ cao của huyết thanh (20%) và dần dần thử nghiệm giảm bớt huyết thanh bởi sự thay đổi nồng độ của các thành phần cấu tạo của mơi trường và thêm vào các yếu tố mới.
III.4 ĐẶC TÍNH VẬT LÝ III.4.1 PH
Hầu hết các dịng tế bào đều tăng trưởng tốt ở pH 7.4. Mặc dù điều kiện thuận lợi về pH đối với sự phát triển của tế bào sẽ thay đổi liên quan đến các kiểu tế bào khác nhau. Dịng nguyên bào sợi bình thường ở Người thích hợp nhất ở pH 7.4 – 7.7.
Phenol Red thường được sử dụng như là một chất chỉ thị. Nĩ cĩ màu đỏ ở pH 7.4, trở nên hồng ở pH 7.0, màu chanh ở pH 6.5, vàng chanh pH dưới 6.5, hơi hồng pH ở 7.6 và tím ở pH 7.8.
III.4.2 DUNG DỊCH ĐỆM
Mơi trường nuơi phải được đệm với do hai điều kiện : 1) Đĩa mở, nơi tạo ra CO2 do pH gia tăng
2) Sự sản sinh quá nhiều CO2 và acid lactic trong một dịng tế bào khi tế bào gia tăng mật độ cao khi đĩ pH sẽ giảm xuống.
Một loại dung dịch đệm phải được sử dụng để kết hợp chặt chẽ trong mơi trường để giữ pH khơng thay đổi nhưng trong phản ứng (1) sản phẩm CO2 ngoại sinh cĩ lẽ cần cho vài dịng tế bào, đặc biệt ở nồng độ tế bào thấp, và ngăn chặn tổng lượng CO2 hồ tan mất đi và Bicarbonate từ mơi trường.
Dung dịch đệm Bicarbonate được sử dụng thường xuyên hơn các dung dịch đệm khác do chúng cĩ khả năng đệm ở mức thấp hơn pH sinh lý, tạo ra ít độc tố, giá thấp và cĩ giá trị dinh dưỡng cho việc nuơi tế bào.
HEPES là một loại dung dịch đệm mạnh, cĩ khả năng đệm ở pH khoảng 7.2 – 7.6 và được sử dụng ở 10 hoặc 20 mM. Khi HEPES được sử dụng với CO2 ngoại sinh, khi đĩ nồng độ của dung dịch HEPES cần được dùng với lượng nhiều hơn hoặc gấp đơi của lượng Bicarbonate tương ứng.
III.4.3 ÁP SUẤT THẨM THẤU
Hầu hết tế bào được nuơi cĩ một giới hạn chịu đựng khá rộng về áp suất thẩm thấu. Áp suất thẩm thấu của huyết tương người là 290mOsm/kg và người ta cho đây là áp suất tối ưu cho những trường hợp nuơi tế bào người trong điều kiện in vitro, mặc dù cĩ sự khác nhau đối với các loại tế bào khác nhau.
Trong thực tế, áp suất thẩm thấu giữa 260mOsm/kg và 320 mOsm/kg được khá chấp nhận cho hầu hết những tế bào, nhưng nên cĩ một sự chọn lựa và nên giữ ở mức ± 10 mOsm/kg
III.4.4 NHIỆT ĐỘ
Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp lên sự tăng trưởng của tế bào vì nĩ làm ảnh hưởng đến pH do sự gia tăng của các CO2 hồ tan ở nhiệt độ thấp và do sự thay đổi về ion và pKa của dung dịch đệm. pH nên được điều chỉnh thấp hơn 0.2 đơn vị ở nhiệt độ phịng hơn là ở 36.50C là điều liện tốt nhất để tạo ra mơi trường hồn tồn với huyết thanh nếu được sử dụng và ủ mẫu qua đêm ở 36.50C.
III.4.5 TÍNH NHỚT
Tính nhớt của mơi trường bị ảnh hưởng bởi các thành phần của huyết thanh và trong một số trường hợp ảnh hưởng một ít lên sự tăng trưởng tế bào. Tính nhớt trở nên đặt biệt quan trọng khi mà nuơi dịch treo được lắc hoặc khi dịch nuơi được khuấy hoặc khi tế bào được tách ra sau khi trypsin hố. Nếu tế bào bị huỷ hoại bởi những điều kiện này cĩ lẽ nĩ sẽ giảm bớt bởi sự tạo ra tính nhớt của mơi trương.
III.4.6 ÁP LỰC SỨC CĂNG BỀ MẶT VÀ SỰ TẠO BỌT
Áp lực sức căng bề mặt được sử dụng để kiểm sốt sự bám dính của mảnh mơ được cấy nguyên phát với giá thể. Trong nuơi cấy dịch treo với 5% CO2 trong khơng khí thì bọt được tạo ra trong mơi trường chứa huyết thanh. Sự thêm vào của một Silicone kháng bọt (Dow chemical) hoặc Pluronic F68 (Wyandotte) giúp cải thiện điều này bởi làm giảm áp lực sức căng bề mặt.
Ảnh hưởng của sự tạo bọt chưa được xác định rỏ ràng như là tỉ lệ của sự biến tính protein khi gia tăng và nguy cơ của việc nhiễm gia tăng nếu sự tạo bọt gia tăng đến cổ của lọ nuơi, tốt nhất là nên tránh.