IV.1 THÀNH PHẦN MƠI TRƯỜNG
Thành phần mơi trường nuơi cấy tế bào động vật phức tạp hơn rất nhiều so với mơi trường nuơi cấy vi sinh vật và tế bào thực vật. Trong các cơng trình đầu tiên về nuơi cấy tế bào động vật, người ta dùng hỗn hợp dung dịch muối sinh lý, huyết thanh và chiết phẩm phơi gà làm mơi trường nuơi cấy. Do thành phần huyết thanh và chiết phầm phơi gà rất phức tạp, khĩ ổn định nên người ta dần dần quan tâm đến việc nghiên cứu chế tạo ra các mơi trường tổng hợp để cĩ thể chủ động bảo quản, sử dụng, điều chỉnh thành phần mơi trường và ổn định mơi trường trong những lần nuơi cấy khác.
Hiện nay, trừ những dịng tế bào đã được thiết lập với mơi trường tổng hợp hồn tồn, đa số các dịng tế bào được nuơi cấy trong mơi trường tổng hợp cĩ bổ sung 5 – 10% huyết thanh (cĩ dịng tế bào cần bổ sung 20% huyết thanh).
IV.1.1 DUNG DỊCH MUỐI ĐỆM
Dung dịch đệm cĩ thể dùng cho các cơng việc sau:
+ Dùng để ủ, khơng cần dinh dưỡng
+ Rửa, xử lý mơ cấy
+ Dùng cho cấy dịch treo Một số dung dịch đệm thường dùng :
HBSS, EBSS và PBS liên quan đến tính đệm yếu của phosphate, chúng là những dung dịch đệm khơng ảnh hưởng xấu ở pH sinh lý.
HEPES (10 – 20mM) hiện tại là dung dịch đệm hiệu quả nhất trong khoảng pH 7.2 – 7.8 và TRICINE trong khoảng pH 7.4 – 8.0
IV.1.2 AMINO ACID
Amino acid cần thiết cần phải được bổ sung cho việc nuơi tế bào với sự thêm vào của cystein và tyrosine, mặc dù nhu cầu riêng đối với các amino acid sẽ thay đổi từ tế bào này đến tế bào khác. Nồng độ của amino acid giới hạn mật độ tối đa của tế bào cĩ thể đạt đến và sự cân bằng cĩ lẽ ảnh hưởng đến sự tồn tại của tế bào và tỉ lệ tăng trưởng.
Glutamine cần được thêm vào bởi hầu hết các dịng tế bào mặc dù vài dịng tế bào sẽ dùng glutamate. Nhưng glutamine được sử dụng bởi những tế bào nuơi như một nguồn năng lượng và Cacbon [38].
IV.1.3 VITAMINE
Mơi trường Eagles’s MEM chỉ chứa vitamine nhĩm B những chất bổ sung khác sẽ lất từ huyết thanh. Sự giới hạn vitamine được biểu hiện trong khoảng thời gian tồn tại của tế bào và tỉ lệ tăng trưởng hơn là mật độ tối đa của mơi trường.
IV.1.4 MUỐI
Muối chủ yếu là những muối của Na+, K+,Mg+,Ca+,Cl-,SO42-,PO43- và HCO3- và những thành phần lớn khác tạo ra áp suất thẩm thấu của mơi trường.
Calcium làm giảm việc tách tế bào và sự bám dính đối với nuơi dịch treo. Nồng độ sodium bicarbonate được xác định bởi nồng độ CO2 trong pha khí, cĩ vai trị dinh dưỡng và khả năng đệm.
IV.1.5 GLUCOSE
Glucose cĩ mặt hầu hết trong các mơi trường như là một nguồn năng lượng. Chúng được chuyển hố bởi quá trình đường phân tạo ra pyruvate và tham gia vào chu trình acid citric để tạo ra CO2. Trong mơi trường nếu cĩ tích luỹ acid lactic chứng tỏ chu trình acid citric khơng hồn tồn như trong cơ thể.
Ngồi ra cịn cĩ một số cơ chất phụ hữu cơ cĩ mặt trong mơi trường như : protein, peptides, nucleosides, các chất trung gian của chu trình acid citric, pyruvate và lipids … Ngồi ra, thành phần phụ của mơi trường cĩ ý nghĩa quan trọng đĩ là huyết thanh.
IV.1.6 HUYẾT THANH
Huyết thanh được sử dụng hầu hết trong nuơi mơ là huyết thanh lấy từ bê con, thai bị, ngựa và người. Huyết thanh bêø được sử dụng rộng rãi nhất, tiếp theo là huyết thanh bị cĩ thai (Fetal Bovine Serum). Chúng được sử dụng cho các dịng tế bào cĩ nhu cầu huyết thanh cao và đối với việc tạo dịng. Thỉnh thoảng huyết thanh người cũng được sử dụng cho một số nghiên cứu tế bào trên người và ngồi ra cũng dùng huyết thanh ngựa do chúng cĩ độ đồng nhất giữa các lơ cao.
Tuy nhiên, cĩ những dịng tế bào tăng trưởng khơng cần đến sự cĩ mặt của huyết thanh như một số dịng tế bào ung thư : dịng tế bào ung thư L929 và dịng tế bào ung thư Hela lần đầu tiên được nuơi khơng cần huyết thanh [18,25,33]. Kết quả từ phịng thí nghiệm của Ham [29]; Sato [17]; Carney [20] và những người khác đã chứng minh rằng huyết thanh cĩ thể được giảm bớt hay loại bỏ nếu dịng tế bào nghiên cứu thích hợp với một mơi trường nuơi với chất dinh dưỡng và hormone thay thế cĩ trong mơi trường phù hợp với chúng.
Những yếu tố cần thiết trong huyết thanh được chú ý bao gồm: 1. Nhân tố bám dính như là fibronectin
2. Những peptide điều khiển sự tăng trưởng và biệt hĩa như là: insulin, PDGF và TGF - β.
3. Chất dinh dưỡng cần thiết như là chất khống, vitamin, acid béo và chất chuyển hĩa trung gian.
4. Hormone kiểm sốt sự vận chuyển qua màng, kiểu hình cơ thể và cấu tạo bề mặt tế bào như là insulin, hydrocortisone, estrogen và triiodotyrosine.
Tuy nhiên, trong hầu hết các loại mơi trường nuơi cấy tế bào động vật đều cĩ mặt huyết thanh vì nĩ cĩ những vai trị quan trọng như sau:
− Cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như các amino acid thiết yếu, tiền chất của nucleic acid, các nguyên tố vi lượng…
− Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích cho tế bào tăng trưởng và phân chia.
− Kích thích sự phục hồi các tổn thương của tế bào khi cấy chuyền và các protein trong huyết thanh làm bất hoạt trypsin tránh các enzyme gây tổn thương cho tế bào.
− Cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng.
− Cải thiện tính dính của tế bào lên bề mặt bình nuơi nhờ các yếu tố làm tăng độ dính của tế bào lên giá đỡ.
− Chống oxy hĩa: huyết thanh cĩ tính kháng oxy hĩa mạnh và ức chế độc tính của oxy.
Huyết thanh rất cần cho nuơi cấy tế bào động vật, tuy nhiên huyết thanh làm tăng giá thành nuơi cấy lên rất nhiều (chiếm 90% giá thành của mơi trường nuơi cấy). Ngồi ra, huyết thanh cịn dễ bị nhiễm virus, mycoplasm và khĩ ổn định chất lượng của những lơ mơi trường khác nhau cũng như cịn chứa những thành phần gây ức chế sự phân bào của một số tế bào đặc biệt (do đĩ cần chọn loại huyết thanh phù hợp khơng
chứa yếu tố ức chế đối với dịng tế bào nuơi cấy). Vì các lý do đĩ mà nhiều nhà nghiên cứu đã xây dựng mơi trường nuơi cấy tế bào động vật khơng dùng huyết thanh hay dùng với lượng thấp.
IV.2 MỘT VÀI LOẠI MƠI TRƯỜNG ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NUƠI CẤY TẾ BÀO VÀ MƠ ĐỘNG VẬT
IV.2.1 Mơi trường BM (Basal Medium ): đây là mơi trường cơ bản do H. Eagle thiết lập, khi dùng phải bổ sung 5 – 10% huyết thanh và amino acid, vitamin với chủng loại và số lượng tùy loại tế bào. Thường sử dụng nuơi cấy tế bào HeLa, tế bào L.
IV.2.2 Mơi trường EMEM (Eagle Minimal Essential Medium): cịn gọi là mơi trường tối thiểu, do H. Eagle thiết lập. Đây là mơi trường BM cĩ chứa nồng độ cao hơn các amino acid và vitamin, cũng cần bổ sung 5 – 10% huyết thanh khi nuơi cấy tế bào.
IV.2.3 Mơi trường DMEM (Dulbecco – Modified Eagle Medium): là mơi trường EMEM do Dulbecco cải tiến với thành phần một số amino acid cao gấp hai lần và một số vitamin cao gấp bốn lần so với số mơi trường khác để nuơi được nhiều loại tế bào hơn.
IV.2.4 Mơi trường F10, F12: do R. Ham thiết lập dùng cho nguyên bào sợi, trong mơi trường này huyết thanh được thay bằng 20µg/ml albumin huyết thanh hoặc bằng 3.10-7M acid linoleic.
IV.2.5 Mơi trường Iscove: do N.N. Iscove thiết lập trên cơ sở tiếp tục cải biến mơi trường DMEM.
IV.2.6 Mơi trường 5A: do T.A. Mc.Coy thiết lập, thường được dùng cho tế bào bệnh bạch huyết.
IV.2.7 Mơi trường RPMI – 1640: được G.E. Moore thiết lập tại Viện nghiên cứu Roswell Part Memorial, được dùng để nuơi tế bào và mơ bạch huyết.
IV.2.8 Mơi trường 199: do R.C. Parker thiết lập dùng để nuơi tế bào mơ cơ phơi gà trong sản xuất vaccin phịng bệnh bại liệt [6].
IV.3 ĐẶC ĐIỂM BA LOẠI MƠI TRƯỜNG EMEM, DMEM VÀ AMNIOMAX ĐƯỢC SỬ DỤNG ĐỂ NUƠI NGUYÊN BÀO SỢI TRONG ĐỀ TÀI NÀY
IV.3.1 MINIMUM ESSENTIAL MEDIUM (MEM) (1X) LIQUID IV.3.1.1 MƠ TẢ SẢN PHẨM
Chứa dung dịch muối Hank và L-glutamine
Minimum Essential Medium (MEM), cịn gọi là mơi trường tối thiểu, được thiết lập bởi Harry Eagle, là một trong những mơi trường tổng hợp dùng để nuơi tế bào được sử dụng rộng rãi nhất. Những thử nghiệm sớm nhất dùng để nuơi nguyên bào sợi của động vật hữu nhủ và dùng để cấy chuyền dịng tế bào HeLa cần những nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt mà chúng ta khơng thể gặp trong Eagle's Basal Medium (BME). Đây là mơi trường cơ bản cĩ chứa nồng độ cao hơn các amino acid và vitamin, cũng cần bổ sung 5 – 10% huyết thanh khi nuơi cấy tế bào. MEM gồm cĩ một nồng độ cao của các amino acid để tạo ra một mơi trường gần giống với thành phần protein của tế bào động vật hữu nhủ. MEM đã được sử dụng cho nuơi cấy đối với số lớn các loại tế bào tăng trưởng tạo ra lớp đơn.
Sự lựa chọn thành phần bổ sung của các amino acid khơng cần thiết để tạo ra cơng thức mơi trường cĩ sự kết hợp của dung dịch muối Hank hoặc Eagle (Hanks' or Eagles' salts) tạo ra một cách sử dụng rộng rãi loại mơi trường này. Cơng thức đã được cải biến xa hơn là đã loại bỏ Calcium cho phép tế bào tăng trưởng được trong nuơi dịch treo. Cơng thức mơi trường gốc của MEM chứa muối Earle và nhĩm amino acid thơng thường được đề cập như là các amino acid cần thiết. Chúng được cần thiết quan tâm đến bởi vì tế bào sẽ khơng tăng trưởng trên mơi trường mà nếu khơng cĩ sự hiện diện của chúng. Mười hai amino acid cần thiết là L-arginine; L-cystine; L-glutamine; L-
histidine; L-isoleucine; L-leucine; L-methionine; L-phenylalanine; L-threonine; L- tryptophan; L-tyrosine và L-valine [24,47].
IV.3.1.2 THÀNH PHẦN MƠI TRƯỜNG EMEM (Catalog Number: 21575 - 022 ) COMPONENTS Molecular Weight Concentration (mg/L) Molarity (mM) Amino Acids L-Arginine hydrochloride 211 126 0.597 L-Cystine 240 21 0.0875 L-Glutamine 146 292 2.00 L-Histidine hydrochloride-H2O 210 42 0.200 L-Isoleucine 131 52 0.397 L-Leucine 131 52 0.397 L-Lysine hydrochloride 183 73 0.399 L-Methionine 149 15 0.101 L-Phenylalanine 165 32 0.194 L-Threonine 119 48 0.403 L-Tryptophan 204 10 0.0490 L-Tyrosine 181 36 0.199 L-Valine 117 46 0.393 Vitamins
Choline chloride 140 1 0.00714 D-Calcium pantothenate 477 1 0.00210 Folic Acid 441 1 0.00227 i-Inositol 180 2 0.0111 Niacinamide 122 1 0.00820 Pyridoxal hydrochloride 204 1 0.00490 Riboflavin 376 0.1 0.000266 Thiamine hydrochloride 337 1 0.00297 Inorganic Salts
Calcium Chloride (CaCl2-2H2O) 147 185 1.26 Magnesium Chloride (MgCl2-
6H2O)
203 100 0.493
Magnesium Sulfate (MgSO4- 7H2O)
246 100 0.407
Potassium Chloride (KCl) 75 400 5.33 Potassium Phosphate monobasic
(KH2PO4)
136 60 0.441
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) 84 350 4.17 Sodium Chloride (NaCl) 58 8000 137.93 Sodium Phosphate monobasic
(NaH2PO4) anhydrous
Other Components
D-Glucose (Dextrose) 180 1000 5.56
Phenol Red 376.4 10 0.0266
IV.3.1.3 ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN
Giữ bột mơi trường khơ ở 2 - 8OC dưới điều kiện khơ và chất lỏng mơi trường ở 2- 8OC trong tối.
IV.3.1.4 CÁCH THỨC SỬ DỤNG
Dùng cho chẩn đốn in vitro.
IV.3.2 DULBECCO’S MODIFIED EAGLE’S MEDIUM
Là mơi trường EMEM do Dulbecco cải tiến với thành phần một số amino acid cao gấp hai lần và một số vitamin cao gấp bốn lần so với mơi trường khác để nuơi được nhiều loại tế bào hơn.
IV.3.2.1 MƠ TẢ SẢN PHẨM
Nhiều sự biến đổi của Eagle’s Medium đã được phát triển sau khi cơng thức mơi trường đầu tiên xuất hiện trong những tài liệu. Giữa những cách sử dụng rộng rãi nhất của sự biến đổi là DULBECCO’S MODIFIED EAGLE’S MEDIUM (DME). DME là sự biến đổi của Basal Medium Eagle (BME) mà nĩ cĩ chứa một nồng độ cao của các amino acid và các vitamin, và cịn thêm vào các thành phần phụ. Cơng thức mơi trường gốc của DME chứa 1000mg/L glucose và đã được thơng báo lần đầu tiên cho việc nuơi những tế bào mầm phơi chuột. Xa hơn nữa của sự biến đổi được tạo ra với 4500 mg/l glucose đã được cải tiến để tối ưu trong việc nuơi được nhiều kiểu tế bào hơn [23,35,39,41].
IV.3.2.2 THÀNH PHẦN CỦA DMEM
Thành phần g/L
Inorganic Salts g/L
Calcium Chloride (anhydrous) 0.2 Ferric Nitrate•9H2O 0.0001 Magnesium Sulfate (anhydous) 0.09767
Potassium Chloride 0.4
Sodium Chloride 6.4
Sodium Phosphate Monobasic (anhyydrous) 0.109 Amino Acids g/L L-Arginine•HCL 0.084 L-Cystein•2HCL 0.0626 L-Glutamine 0.584 Glycine 0.030 L-Histidine•HCL•H2O 0.042 L-Isoleucine 0.105 L-Leucine 0.105 L-Lysine•HCL 0.146 L-Methionine 0.030 L-Phenylalanine 0.066 L-Serine 0.042 L-Threonine 0.095 L-Tryptophan 0.016 L-Tyrosine•2Na•2H2O 0.10379
L-Valine 0.094 Vitamins g/L Choline Chloride 0.004 Folic Acid 0.004 Myo-Inositol 0.0072 Niacinamide 0.004
D-Pantothenic Acid (hemicalcium) 0.004
Pyridoxal•HCL 0.004
Riboflavin 0.0004
Thiamine•HCL 0.004
Other Components g/L
D-Glucose 1.0
IV.3.2.3 ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN
Giữ bột mơi trường khơ ở 2 - 8OC dưới điều kiện khơ và chất lỏng mơi trường ở 2- 8OC trong tối.
IV.3.2.4 ĐẶC TÍNH MƠI TRƯỜNG
Mơi trường được kiểm sốt chất lượng thơng qua các yếu tố sau : Sự hiện diện bột màu trắng nhạt
Hơi ẩm chứa ≤2.0%
Tính tan được dịch trong ở nồng độ 1X pH ở RT (khơng cĩ sodium
bicarbonate)
6.2 ± 0.3 pH ở RT (cĩ sodium bicarbonate) 7.7 ± 0.3
sodium bicarbonate)
Aùp suất thẩm thấu (cĩ sodium bicarbonate)
310mOsm/kgH2O ± 5%
Độc tố ≤ 1.0EU/ml ở 1X
Phân tích Amino Acid bởi HPLC phân tích cho rằng amino acid hiện diện ở nồng phù hợp với cơng thức tạo thành
Phân tích yếu tố chủ chốt bởi ICAP phân tích cho rằng yếu tố chủ chốt hiện diện ở nồng phù hợp với cơng thức tạo thành
IV.3.3 SẢN PHẨM AMNIOMAX™-C100 IV.3.3.1 MƠ TẢ SẢN PHẨM
Mơi trường AMNIOMAX dùng để nuơi tế bào dịch ối và mẫu mơ gai nhau đệm. Kết quả nuơi các tế bào dịch ối trên mơi trường này đã chứng minh được rằng các tế bào cĩ hình dạng giống nguyên bào sợi, được sử dụng để ứng dụng trong chẩn đốn trước sinh.
Sản phẩm AmnioMax được phát triển đặc biệt cho cơng việc thử nghiệm chẩn đốn in vitro mẫu tế bào dịch ối người và được thiết kế để các thí nghiệm tiến hành một cách đơn giản. Mỗi cơng thức mơi trường được tối ưu bằng việc thử nghiệm trên mẫu tế bào dịch ối được nuơi thứ cấp bám dính vào giá thể để kiểm sốt sự tăng trưởng.. Mỗi một sản phẩm được thử nghiệm tương tự nhau với kết quả rất nghiêm ngặt để chắc chắn cần thiết cho phép ứng dụng.
Mơi trường AmnioMax được tạo thành, sẵn sàng sử dụng và hồn tồn cĩ chứa kháng sinh, L-glutamine và FBS thích được thêm vào hay khơng là tuỳ người sử dụng.
Hệ thống bao gồm mơi trường cơ bản AmnioMAX™-C100 (Cat. No. 17001 – 082, 90 ml) và AmnioMAX™-C100 Supplement (Cat. No. 12556-015, 15 ml). Nĩ được tạo thành với kháng sinh và thành phần kiểm sốt sự tăng trưởng và khơng thêm các thành phần khác. Mơi trường và thành phần bổ sung tách rời nhau.
IV.3.3.2 CƠNG THỨC MƠI TRƯỜNG
Mơi trường được cấu tạo bao gồm :
IV.3.3.3 ĐIỀU KIỆN GIỮ:
Đối với mơi trường giữ ở nhiệt độ từ 2OC đến 8OC, trong bĩng tối. Đối với thành phần bổ sung giữ ở nhiệt độ từ –50C đến 200C.
IV.3.3.4 CÁCH THỨC SỬ DỤNG:
Dùng cho chẩn đốn in vitro.
V. ỨNG DỤNG CỦA VIỆC NUƠI CẤY NGUYÊN BÀO SỢI V.1 ỨNG DỤNG TRONG LĨNH VỰC Y HỌC