X. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ
Thời gian kiểm tra VP
− Khơng cĩ được nguồn nước đảm bảo tiêu chuẩn cho pha mơi trường nuơi cấy phơi chuột.
Trong khi đĩ, mơi trường FertiCult IVF (FertiPro) là mơi trường thương mại được sử dụng cho phơi người, tuy nhiên nĩ cũng hỗ trợ cho sự phát triển của phơi chuột qua chứng nhận chất lượng lơ hàng với > 80% phơi chuột đạt giai đoạn blastocyst. Và mơi trường này được nhà trường hỗ trợ và đồng ý trong nghiên cứu này.
Bàn luận kết quả đối với thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ BSA trong mơi trường nuơi cấy lên sự phát triển của phơi chuột?
Kết quả (Bảng 10, Hình 24) cho thấy việc bổ sung BSA vào mơi trường nuơi cấy cĩ tác dụng làm tăng khả năng phát triển của phơi chuột trong nuơi cấy, và làm tăng rõ rệt khả năng phát triển lên phơi nang từ phơi 2 tế bào khi nuơi cấy. Điều này phù hợp với thí nghiệm của Brinster năm 1965 cho rằng BSA với vai trị là nguồn nitrogen hỗn hợp amino acid khi bị thuỷ phân cần thiết cho sự phát triển của phơi chuột 2 tế bào lên phơi nang trong nuơi cấy, cũng như phù hợp với kết quả của Biggers, Summers và Ginnis vào năm 1997 cho rằng BSA khi bổ sung vào mơi trường nuơi cấy làm tăng khả năng phát triển lên phơi nang của phơi chuột 2 tế bào.
Lý do BSA làm tăng sự phát triển phơi vẫn khơng được biết rõ ràng, cĩ thể cĩ ít nhất 3 khả năng:
(1) BSA làm tăng amino acid được bổ sung
(2) BSA cung cấp những phân tử khơng phải amino acid được kết hợp kích thích sự phát triển
(3) BSA cung cấp những chức năng bắt giữ.
Tuy nhiên, kết quả thí nghiệm này lại trái ngược với kết quả cuả Evencen và Alkan rằng nồng độ BSA trên 1% sẽ ức chế sự phát triển của phơi chuột trong nuơi cấy. Kết quả thí nghiệm này lại cho thấy rằng: nồng độ BSA bổ sung là 1,2% (>1%) lại là nồng độ cho kết quả phơi chuột 2 tế bào phát triển lên phơi nang cao nhất.
Điều này cĩ thể do điều kiện thí nghiệm khác nhau về: mơi trường, chủng chuột, cũng như điều kiện thí nghiệm. Trong thí nghiệm của Evencen và Alkan sử dụng mơi trường M16 và mơi trường Whitten’s, chủng chuột lai F1 CB6, điều kiện nuơi cấy là 5%CO2, 5%O2, 90%N2, độ ẩm 100%. Trong khi đĩ, với điều kiện thí nghiệm thực tế cĩ được, điều kiện thí nghiệm hiện tại khơng được tối ưu cả về mặt mơi trường, chủng chuột và điều kiện chất lượng thí nghiệm. Với những điều kiện thí nghiệm hiện tại khơng đảm bảo về tiêu chuẩn thí nghiệm thì những vai trị của BSA như: bắt giữ các độc tố, các kim loại nặng, điều hồ quá trình oxi hố, chất bảo vệ bề mặt tế bào, hoặc chất bảo vệ enzyme làm BSA với nồng độ cao trở nên cĩ vai trị quan trọng trong nuơi cấy phơi.
Qua kết quả thống kê ở giai đoạn phơi dâu nồng độ 0,4 và 1,2% khơng cĩ sự khác biệt về ý nghĩa thống kê, mặc dù cĩ sự khác biệt rõ rệt về giá trị trung bình. Điều này cho thấy ở giai đoạn phát triển phơi dâu ở nồng độ BSA 0,4% cĩ sự sai số khá lớn, cần lập lại thí nghiệm để cĩ kết quả chính xác hơn ở nồng độ này.
Kết quả nuơi cấy phơi 2 tế bào phát triển lên thành phơi nang đạt tỉ lệ cao nhất là 45,24% ở nồng độ BSA 1,2%. Tuy nhiên đây vẫn chưa là kết quả cao nhất, tối ưu nhất, vì hiện tại kết quả nuơi cấy phơi chuột từ 2 tế bào lên phơi nang trên thế giới là 80 – 90%.
Kết quả thí nghiệm cho thấy với điều kiện nuơi cấy hiện tại, và chủng chuột trong nước thì nồng độ BSA cho kết quả tốt nhất trong 3 nồng độ thí nghiệm là 1,2%.
Bàn luận đối với kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của số lượng phơi trong một thể tích nuơi cấy nhất định.
Kết quả thí nghiệm (bảng 11, hình 25) cho thấy, sự phát triển của phơi chuột 2 tế bào lên phơi nang ở thí nghiệm 6 phơi/ 1 giọt mơi trường cao hơn thí nghiệm 10 phơi/1 giọt mơi trường. Cho thấy với chủng chuột và điều kiện nuơi cấy thực tế, nuơi 6 phơi/1 giọt mơi trường cho kết quả tốt hơn 10 phơi/1 giọt mơi trường như được đề nghị.(7)
Tồn bộ hệ thống nuơi cấy với mọi khía cạnh: khơng khí, thể tích nuơi cấy, số lượng phơi trong nhĩm nuơi cấy, sự bổ sung các đại phân tử … đều cĩ tác động lẫn nhau và tác động lên sự phát triển của phơi. Số lượng lớn phơi trong một thể tích mơi trường nuơi cấy sẽ ức chế sự phát triển vì phơi sẽ chuyển hố các chất tạo ra nguồn dinh dưỡng cho mình đồng thời sự chuyển hố cũng tạo ra một số chất độc hại đối với phơi (ví dụ phơi khi chuyển hố sẽ khử gốc amin của các amino acid tạo ra ammonium ảnh hưởng xấu tới sự phát triển của phơi), làm mơi trường khơng đủ nguồn chất dinh dưỡng cung cấp cho sự phát triển của phơi. Tuy nhiên, số lượng lớn phơi trong một thể tích mơi trường nuơi cấy cũng cĩ lợi cho sự phát triển của phơi do phơi tạo ra những nhân tố actocrine/paracrine đặc biệt sẽ kích thích sự phát triển.
Vì vậy tìm được một số lượng phơi thích hợp trong một thể tích nuơi cấy xác định sẽ làm tăng khả năng phát triển của phơi. Trong điều kiện nuơi cấy thực tại, nguồn mơi trường, chủng chuột và điều kiện thí nghiệm khơng tối ưu thì việc nuơi 6 phơi/giọt mơi trường cho kết quả tốt hơn trong nuơi 10 phơi/giọt mơi trường.
Bàn luận kết quả thí nghiệm ảnh hưởng trong kích thích buồng trứng.
Số trứng hoặc phơi chuột thu nhận được từ chuột cái được kích thích buồng trứng là 23,42 trứng (phơi) ổn định và số lượng phù hợp trong khoảng tiêu chuẩn kích thích. Điều này cĩ nghĩa là việc sử dụng thuốc kích thích rụng trứng PMSG (PMSG 1000IU, Viện Chăn nuơi Quốc gia) và hCG (Pregnyl 1500IU, N.V.Organon, Hà Lan), với thời gian tiêm 2 loại kích dục tố cách nhau 48 giờ, cho kết quả tốt và ổn định. (Hình 26)
Bàn luận kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của nguồn chuột và điều kiện nuơi ổn định chuột đến khả năng giao phối của chuột. (Bảng 13)
Đối với nguồn chuột mua từ viện Pasteur với tiêu chuẩn chọn chuột là 20 – 30g khơng kiểm sốt được độ tuổi của chuột cũng như chất lượng chuột thì kết quả giao phối cho thấy nguồn chuột thí nghiệm này là khơng đảm bảo được chất lượng. Đối với nguồn chuột mua từ Pasteur ở dạng chuột ổ (1-2 tuần tuổi) nuơi ổn định tới khi thí nghiệm, thì tuổi của chuột, trọng lượng và chất lượng của chuột được kiểm sốt hồn tồn, chuột cho kết quả giao phối là rất cao (93,75%).
Bàn luận kết quả thí nghiệm kiểm tra vai trị của nút nhầy âm đạo trong xác định chuột phối. (Bảng 14)
Kết quả kiểm tra nút nhầy chuột cái (Hình 27) cho thấy biên độ thời gian giao phối của chuột rất rộng. Vì vậy, việc thiết kế một quy trình tạo phơi như các tài liệu nước ngồi được đề nghị: chuột sau khi tiêm hCG sẽ cho phối với chuột đực, kiểm tra nút nhầy vào sáng ngày hơm sau, sau đĩ tách chuột(5,6,7,8) sẽ khơng phù hợp với điều kiện thực tế.
Vai trị của nút nhầy trong việc xác định chuột phối (Bảng 13) là khơng luơn chính xác. Chuột được kiểm tra cĩ VP(+) luơn cĩ phối nhưng cũng cĩ trường hợp chuột cĩ phốii (thu nhận được phơi 2 tế bào theo đúng lịch thí nghiệm) nhưng kết quả kiểm tra VP(-). Tuy nhiên, số lượng chuột cĩ VP(-) nhưng cĩ phối chỉ chiếm 11% trong tổng số chuột cĩ VP(-) và khơng phối.
III. KẾT LUẬN
a. Trong phạm vi nghiên cứu này, mục đích cuối cùng là khảo sát một số điều kiện nuơi cấy nhằm gĩp phần cải thiện kết quả nuơi cấy trong những thí nghiệm vừa qua. Kết quả nghiên cứu cho thấy trong những điều kiện thí nghiệm đã trình bày tỉ lệ phát triển của phơi chuột từ 2 tế bào lên phơi nang đạt kết quả cao nhất với lơ thí nghiệm:
6 phơi/giọt mơi trường 50µl
Nồng độ BSA bổ sung tốt nhất là 1,2%
− Kết quả thí nghiệm cho thấy ở nồng độ BSA bổ sung là 1,2% vẫn khơng xảy ra việc ức chế sự phát triển của phơi giai đoạn trước làm tổ trong nuơi cấy trong ống nghiệm. Tuy nhiên đây vẫn chưa là điều kiện phát triển tối ưu nhất vì tỉ lệ phát triển lên phơi nang vẫn cịn thấp (dưới 50%) và chưa thật sự ổn định. Số lượng thí nghiệm vẫn chưa đạt được số lượng thống kê cần thiết do thời gian thí nghiệm cịn bị giới hạn, và bị giới hạn về nguồn mẫu.
b. Cách tạo nguồn phơi:
Với điều kiện thí nghiệm chuột mua từ viện Pasteur, và được ổn định theo chù kì sáng tối từ 19 giờ – 7 giờ (chu kì tối) trong thời gian 1 tuần trước khi tiến hành thí nghiệm, thời gian tiêm thuốc kích thích siêu bài nỗn là 17 giờ, khoảng cách giữa thời gian tiêm PMSG và hCG là 48 giờ, cho phối và thu phơi, kết quả thu lượng phơi cĩ những vấn đề sau:
i. Liều lượng, thời gian tiêm kích dục tố, chất lượng thuốc gây kích thích buồng trứng là phù hợp với 2 sản phẩm PMSG (Viện Chăn nuơi Quốc gia), và Pregnyl (N.V.Organon, Hà Lan).
ii. Chuột mua từ viện Pasteur theo tiêu chuẩn trọng lượng chuột là khơng đảm bảo được chất lượng, tốt nhất nên ổn định từ chuột ổ (khoảng 1 – 2 tuần tuổi).
− Nút nhầy âm đạo khơng luơn là dấu hiệu tốt cho việc xác định chuột đã được giao phối. Tuy nhiên, với tỉ lệ chỉ 11% chuột cĩ VP(-) cĩ phối nên việc kiểm tra nút nhầy vẫn cĩ ý nghĩa là dấu hiệu cho việc xác định chuột đã phối.
− Biên độ về thời gian giao phối của nguồn chuột được sử dụng trong thí nghiệm rất rộng.
IV. ĐỀ NGHỊ
• Tiến hành thí nghiệm với mơi trường chuyên biệt sử dụng cho chuột, tiến hành những thí nghiệm rộng hơn về nồng độ BSA và số lượng phơi trong giọt nuơi cấy.
• Sự dụng chuột thí nghiệm kiểm sốt được độ tuổi và trọng lượng của chuột, tốt nhất là sử dụng chuột nuơi ổ.
• Trong việc xác đinh chuột giao phối qua nút nhầy âm đạo khơng luơn ổn định nhưng tỉ lệ VP(-) chuột cĩ phối là khơng cao, nên chuột khi đã cho phối chỉ nên tiến hành thu phơi khi kiểm tra cĩ nút nhầy. Chuột cho phối vào ngày D-1, nên nhốt chung chuột đực và cái cho tới sáng ngày thu phơi. Chuột cho phối thơng thường nên thu phơi vào khoảng trưa ngày D1 (khoảng 14 – 15 giờ) để đảm bảo là phơi 2 tế bào thu đủ muộn.
• Với kết quả tỉ lệ phát triển của phơi chuột 2 tế bào lên phơi nang là 45,23% việc tiếp tục sử dụng kết quả nuơi cấy vào các ứng dụng cao hơn, chuyển phơi, hoặc nuơi cấy phơi tới giai đoạn thốt nang và sử dụng tiếp tục nuơi cấy tế bào mầm là khả quan và nên tiếp tục được thực hiện.
Tài liệu tiếng Việt
1. Phan Kim Ngọc. 2002. Giáo trình thực tập cơ sở Cơng Nghệ Sinh Học Động
Vật, nxb. Đại học quốc gia tp Hồ Chí Minh, trang 72-111.
2. Phan Kim Ngọc, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2000. Sinh học của sự sinh sản, nxb. Giáo dục, trang 5-10, 84-100.
3. Nguyễn Văn Uyển, Nguyễn Văn Thắng, 2000, Những kiến thức cơ bản về
cơng nghệ sinh học, nxb. Giáo dục, trang 203-229.
Tài liệu tiếng nước ngồi
4. Alan O. Trounson, David K. Gardner. 2000. Embryo culture systems. Trong
Handbook of In Vitro Fertilization, Second edition, CRC Press, trang 206-248.
5. Andras Nagy, Marina Gertsenstein, Kristina Vintersten, Richard Behringer. 2003. Developmental genetics and embryology of the mouse, Summary of mouse development, Production of transgenic and chimeric mice, Setting up a micromanipulation lab. Trong Manipulating the Mouse Embryo, A laboratory Manual, Third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, trang 2-20, 32-121, 142-159, 708-723.
6. David K Gardner, Ariel Weissman, Colin M Howles, Zeev Shoham. 2001. Embryo culture. Trong Textbook of Assisted Reproductive Techniques, Laboratory and Clinical Perspectives, Martin Dunitz, trang 203-222.
7. Jose Cibelli, Robert P. Lanza, Keith H.S. Campbell, Michael D. West. 2002. Development of viable mamalian embryos in vitro: evolution of sequential media. Trong Principles of Cloning, Elsevier Science (USA), trang 187-208.
8. M Monk, Mouse husbandry, Isolation, culture and manipulation of preimplantation mouse embryos. Trong Mammalian development – a practical
9. Nancy Ford, Judy Cuddihy, Summary of mouse development, Setting up a colony for the production of transgenic mice, Recovery, culture and transfer of embryos. Trong Manipulating the Mouse Embryo, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Publication Department, n.d, trang 17-147.
10. Scott F. Gilbert. 1985. Cell interactions at a distance: hormones as mediators of development, Sex determination. Trong Developmental Biology, Sinauer Associates, Inc, trang 603-660.
Tài liệu truy cập internet
11. Mithat Evecen, Serhat Pabuccuogle, Serhat Alkan, I. Kamuran Ileri, The effects of various BSA levels in different media on development in In Vitro culture of mouse embryos, Turk J Vet Anim Sci, 28 (2004) 337-342.
12. John D.Biggers, Michael C.Summers, Lynsa K.McGinnis, Polyvinyl alcohol and amino acids as substitutes for bovine serum albumin in culture media for mouse preimplantation embryos, Human Reproduction Update 1997, vol. 3, No. 2 pp. 125-135.
13. http://www.unicapinvitrosight.com/templates/Allergens.asp?id=2333 14. http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/0775827a.pdf 15. http://www.friedli.com/research/PhD/chapter5.html