A B
Hình 3.6. Kết quả điện di tách plasmid mang gen CP (A: Mẫu Phổ Yên; B: Mẫu Phú Bình)
Chúng tôi chọn khuẩn lạc trắng của dòng 1 và dòng 2 với mẫu Phổ Yên; dòng 8 của mẫu Phú Bình để tách plasmid theo bộ kit của hãng Bioneer. Sản phẩm DNA plasmid đƣợc điện di trên gel agarose 1%. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.6.
Kết quả điện di trên hình 3.6 cho thấy, sản phẩm tách plasmid sạch, đảm bảo chất lƣợng và số lƣợng để tiến hành đọc trình tự nucleotide của gen CP.
3.3. KẾT QUẢ SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN CP CỦA PVY TỪ HAI MẪU NGHIÊN CỨU
Trình tự nucleotide của gen CP đƣợc xác định trên máy đọc tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer theo hai chiều xuôi và ngƣợc. Khi so sánh 2 trình tự này trong BLAST của NCBI, kết quả cho biết đây là các trình tự gen mã hoá CP của PVY ở khoai tây. Chiều dài gen CP ở 2 mẫu Phổ Yên và Phú Bình đều có kích thƣớc 1201 nucleotide, đoạn mã hóa dài 801 nucleotide, protein dài 267 acid amine. Chúng tôi kết luận đã nhân, tách dòng và đọc trình tự thành công đoạn gen mã hoá CP của PVY trên khoai tây.
3.3.1. So sánh trình tự nuclotide và acid amine của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
10 20 30 40 50
Pho Yen GGAAATGACA CAATCGATGC AGGAGGAAGC ACTAAGAAGG ATGCAAAACA
Phu Binh GCAAATGACA CAATTGATGC AGGAGAAAGC AACAAGAAAG ATGCAAAACC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
60 70 80 90 100
Pho Yen AGAGCAAGGT AGCATTCAAC CAAATCTCAA CAAGGAAAAG GAAAAGGACG
Phu Binh AGAGCAAGGC AGCATCCAGT CAAACCTGAA CAAAGGAAAA GATAAGGATG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
110 120 130 140 150
Pho Yen TGAATGTTGG AACATCTGGA ACTCATACTG TGCCACGAAT TAAAGCTATC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
160 170 180 190 200
Pho Yen ACGTCCAAAA TGAGAATGCC CAAGAGTAAA GGTGCAACTG TACTAAATTT
Phu Binh ACGTCCAAAA TGAGAATGCC CAAAAGCAAG GGAGCAACCG TGCTAAATTT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
210 220 230 240 250
Pho Yen GGAACACTTA CTCGAGTATG CTCCACAGCA AATTGACATC TCAAATACTC
Phu Binh AGAACACTTG CTTGAGTACG CTCCACAACA AATTGATATT TCAAATACTC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
260 270 280 290 300
Pho Yen GAGCAACTCA ATCACAGTTT GATACGTGGT ATGAAGCGGT ACAACCTGCA
Phu Binh GGGCAACTCA ATCACAGTTT GATGCGTGGT ATGAGGCAGT GCGGATGGCA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
310 320 330 340 350
Pho Yen TACGACATAG GAGAAACTGA AATGCCAACT GTGATGAATG GGCTTATGGT
Phu Binh TACGACATAG GAGAAACTGA GATGCCAACT GTGATGAATG GGCTTATGGT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
360 370 380 390 400
Pho Yen TTGGTGCATT GAAAATGGAA CCTCGCCAAA CATCAACGGA GTTTGGGTTA
Phu Binh TTGGTGCATT GAAAATGGAA CCTCGCCAAA TGTCAACGGA GTTTGGGTTA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
410 420 430 440 450
Pho Yen TGATGGATGG AGATGAACAA GTCGAATACC CACTGAAACC AATCGTTGAG
Phu Binh TGATGGATGA GAATGAACAA GTTGAGTACC CGTTGAAACC AATCGTTGAG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
460 470 480 490 500
Pho Yen AATGCAAAAC CAACACTTAG GCAAATCATG GCACATTTCT CAGATGTTGC
Phu Binh AATGCAAAAC CAACCCTTAG GCAAATCATG GCACATTTCT CAGATGTTGC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
510 520 530 540 550
Pho Yen AGAAGCGTAT ATAGAAATGC GCAACAAAAA GGAACCATAT ATGCCACGAT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
560 570 580 590 600
Pho Yen ATGGTTTAGT TCGTAATCTG CGCGATGGAA GTTTGGCTCG CTATGCTTTT
Phu Binh ATGGTTTAAT TCGAAATCTG CGGGATGTGG GTTTAGCGCG TTATGCCTTT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
610 620 630 640 650
Pho Yen GACTTTTATG AGGTCACATC ACGAACACCA GTGAGGGCTA GGGAAGCGCA
Phu Binh GACTTTTATG AAGTCACATC ACGAACACCA GTGAGGGCTA GGGAAGCGCA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
660 670 680 690 700
Pho Yen CATTCAAATG AAGGCCGCAG CATTGAAATC AGCCCAACCT CGACTTTTCG
Phu Binh CATTCAAATG AAGGCCGCAG CATTGAAATC AGCCCAACCT CGACTTTTCG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
710 720 730 740 750
Pho Yen GGTTGGACGG TGGCATCAGT ACACAAGAGG AGAACACAGA GAGGCACACC
Phu Binh GGTTGGACGG TGGCATCAGT ACACAAGAGG AGAACACAGA GAGGCACACC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
760 770 780 790 800
Pho Yen ACCGAGGATG TCTCTCCAAG TATGCATACT CTACTTGGAG TCAAGAACAT
Phu Binh ACCGAGGATG TCTCTCCAAG TATGCATACT CTACTTGGAG TCAAGAACAT .
Pho Yen G
Phu Binh G
Hình 3.7. So sánh trình tự nucleotide của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
10 20 30 40 50
Pho Yen GNDTIDAGGS TKKDAKQEQG SIQPNLNKEK EKDVNVGTSG THTVPRIKAI
Phu Binh ANDTIDAGES NKKDAKPEQG SIQSNLNKGK DKDVNAGTSG THTVPRIKAI ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
60 70 80 90 100
Pho Yen TSKMRMPKSK GATVLNLEHL LEYAPQQIDI SNTRATQSQF DTWYEAVQPA
Phu Binh TSKMRMPKSK GATVLNLEHL LEYAPQQIDI SNTRATQSQF DAWYEAVRMA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
Pho Yen YDIGETEMPT VMNGLMVWCI ENGTSPNING VWVMMDGDEQ VEYPLKPIVE
Phu Binh YDIGETEMPT VMNGLMVWCI ENGTSPNVNG VWVMMDENEQ VEYPLKPIVE ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
160 170 180 190 200
Pho Yen NAKPTLRQIM AHFSDVAEAY IEMRNKKEPY MPRYGLVRNL RDGSLARYAF
Phu Binh NAKPTLRQIM AHFSDVAEAY IEMRNKKEPY MPRYGLIRNL RDVGLARYAF ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
210 220 230 240 250
Pho Yen DFYEVTSRTP VRAREAHIQM KAAALKSAQP RLFGLDGGIS TQEENTERHT
Phu Binh DFYEVTSRTP VRAREAHIQM KAAALKSAQP RLFGLDGGIS TQEENTERHT ....|....| ....|..
260
Pho Yen TEDVSPSMHT LLGVKNM
Phu Binh TEDVSPSMHT LLGVKNM
Hình 3.8. So sánh trình tự acid amine của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu Trình tự gen CP-PVY từ 2 mẫu nghiên cứu có sự sai khác ở 71 vị trí nuleotide. Do đó có thể thấy, mức độ tƣơng đồng giữa 2 trình tự này tƣơng đối thấp (91,1%). So sánh protein suy diễn từ 2 trình tự gen này cho thấy mức độ sai khác là 6,4%. Sự biến động về trình tự nucleotide giữa 2 gen không đồng đều, trong khi có những vùng biến động lớn (nhƣ vùng 2 đến 144) thì có những vùng không biến động một nuleotide nào (nhƣ vùng từ 613 đến 801). Sự sai khác về nucleotide dẫn đến sự sai khác về acid amin, tuy vậy có những vùng có sự sai khác về nuleotide không dẫn tới sự sai khác vế acid amin (nhƣ vùng nucleotide từ 108 đến 273).
3.3.2. So sánh trình tự nuclotide gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu với các trình tự gen CP-PVY trên khoai tây đã đƣợc công bố trong ngân hàng gen
Để thấy đƣợc sự đa dạng di truyền ở mức phân tử của PVY, chúng tôi tiến hành so sánh 2 trình tự gen PVY phân lập từ Phú Bình và Phổ Yên với một số trình tự gen PVY khác trên Ngân hàng gen quốc tế NCBI.
Bảng 3.4. 19 trình tự trong ngân hàng gen đƣợc đƣa ra so sánh
Sử dụng phần mềm DNAstar và BioEdit để so sánh các trình tự gen, lập bảng hệ số tƣơng đồng và biểu đồ hình cây biểu diễn quan hệ di truyền của gen CP-PVY ở 2 mẫu nghiên cứu với 19 trình tự trên.
Mã số Chủng
(biến thể) Nƣớc Mã số
Chủng
(biến thể) Nƣớc
DQ925437 PVYNTN Hà Nội-Việt
Nam U91747 PVY
N
USA
M95491 PVYNTN Hungary X97895 PVYN Switzerland
X79305 PVYNTN Austria Z70237 PVYN Polan
X92078 PVYNTN Lebanon AF118153 PVYO India
AJ890345 PVYNTN Germany AY792597 PVYO China
EF016294 PVYNTN UK D12539 PVYO Japan
AB205416 PVYN Japan U09509 PVYO Canada
AF255660 PVYN Brazil X14136 PVYO Argentina
AM268435 PVYN New Zealand X68222 PVYO USA
Hình 3.9. Biểu đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền của CP-PVY phân lập đƣợc từ Phổ Yên và Phú Bình với 19 trình tự trong ngân hàng gen
Kết quả phân tích cho thấy, trình tự gen CP-PVY của 2 mẫu Phổ Yên, Phú Bình có độ tƣơng đồng khá cao (từ 89,3% đến 99,6%) so với các trình tự CP-PVY của các chủng PVY đã công bố. Nhƣ vậy, có thể đƣa ra kết luận: đã phân lập đƣợc thành công gen CP của PVY chứ không phải của một loại virus nào khác.
Trình tự CP-PVY của mẫu ở Phổ Yên có độ tƣơng đồng từ 89,9% đến 91,6% so với các trình tự thuộc chủng PVYO; từ 96,4% đến 97,4% so với các trình tự thuộc chủng PVYN; từ 98,6% đến 99,6% so với các trình tự thuộc chủng PVYNTN. Nhƣ vậy, trình tự CP-PVY phân lập từ Phổ Yên có độ tƣơng đồng với các trình tự CP của các chủng PVYNTN
cao hơn so với các trình tự thuộc chủng khác. Trong đó, nó có độ tƣơng đồng cao nhất (99,6%) với trình
tự có mã số EF016294. Điều này chứng tỏ PVY phân lập tại Phổ Yên-Thái Nguyên thuộc chủng PVYNTN
.
Trình tự CP-PVY phân lập từ Phú Bình có độ tƣơng đồng từ 94,6% đến 98,5% so với các trình tự thuộc chủng PVYO; 90,8% đến 91,5% so với các trình tự thuộc chủng PVYNTN; 89,3% đến 89,6% so với các trình tự thuộc chủng PVYN. Nhƣ vậy, trình tự CP-PVY của mẫu ở Phú Bình có độ tƣơng đồng với các trình tự thuộc chủng PVYO
cao hơn so với các trình tự thuộc chủng khác. Trong đó, nó có độ tƣơng đồng cao nhất (98/5%) với trình tự có mã số Z70239. Điều này chứng tỏ PVY phân lập tại Phú Bình-Thái Nguyên thuộc chủng PVYO
.
Kết quả này cũng phù hợp với phân tích biểu đồ hình cây biểu diễn quan hệ di truyền của gen CP-PVY phân lập từ Phổ Yên, Phú Bình với 19 trình tự trong ngân hàng gen. Biểu đồ này cho thấy 21 trình tự đƣợc chia thành 2 nhóm lớn. Nhóm I lại đƣợc chia thành 2 nhóm phụ. Nhóm phụ I1 gồm các trình tự thuộc chủng PVYNTN
và Phổ Yên. Nhóm phụ I2 gồm các trình tự của chủng PVYO
và Phú Bình.
Theo nghiên cứu của Mohamad Chikh Ali và cs , vị trí acid amine thứ 29 của gen CP-PVY là Gly29 bảo thủ cho các chủng PVYO
, PVYC, PVYNW. Trong khi Gln17 và Glu31 lại bảo thủ trong gen CP của PVYN/PVYNTN (Chikh Ali và cs, 2007) [24]. Trình tự acid amine của CP-PVY của 2 mẫu Phổ Yên và Phú Bình hoàn toàn phù hợp với nhận định của Chikh Ali.
Bảng 3.5. Hệ số giống và khác nhau về trình tự nucleotide vùng mã hoá của gen CP ở mẫu nghiên cứu so với các mẫu trên ngân hàng NCBI
Hệ số kh ác nhau (%) Hệ số giống nhau (%)
KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ
1. KẾT LUẬN
1.1. Đã tiến hành khảo sát, thống kê tỉ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY theo phƣơng pháp quan sát bằng mắt thƣờng. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy phƣơng pháp này có độ tin cậy thấp vì dễ nhầm lẫn với các bệnh khác hay những phản ứng của cây trƣớc điều kiện sinh thái khác nhau.
1.2. Đã nhân đƣợc gen CP bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu từ mẫu lá khoai tây ở Phổ Yên-Thái Nguyên và Phú Bình-Thái Nguyên. Sản phẩm PCR đƣợc dòng hoá nhờ vector pBT. Đoạn mã hóa dài 801 nucleotide và protein gồm 267 acid amine.
1.3. Trình tự gen CP-PVY của 2 mẫu Phổ Yên-Thái Nguyên và Phú Bình-Thái Nguyên có sự sai khác là 8,9%.
1.4. So sánh trình tự đoạn mã hoá của gen CP-PVY ở 2 mẫu nghiên cứu với các mẫu đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế NCBI cho thấy hệ số sai khác dao động từ 0,04% đến 10,7%.
1.5. Đã xác định đƣợc PVY phân lập từ Phổ Yên thuộc chủng PVYNTN, còn PVY phân lập từ Phú Bình thuộc chủng PVYO
.
2. ĐỀ NGHỊ
Tiếp tục đánh giá sự đa dạng cấu trúc gen CP của PVY phân lập từ các khu vực khác để tạo nguồn nguyên liệu phục vụ cho thiết kế vector chuyển gen kháng PVY ở khoai tây.
CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Vũ Thị Bƣởi (2009), “Xác định trình tự gen mã hoá protein vỏ của virus Y trên khoai tây và đánh giá sự đa dạng di truyền của virus này”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 56(8), Nxb Đại học Thái Nguyên.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
[1] Hồ Hữu An, Đinh Thế Lộc (2005), Cây có củ và kĩ thuật thâm canh, NXB Lao động Xã hội, tr 12- 13.
[2] Nguyễn Mạnh Chinh (2005), Khoai tây (Solanum tuberosum),
http://longdinh.com.
[3] Đƣờng Hồng Dật (2005), Cây khoai tây và kĩ thuật thâm canh tăng năng suất, NXB Lao động Xã hội.
[4] Trƣơng Văn Hộ, Trịnh Quốc Mỵ, Nguyễn Văn Đĩnh, P. Vander Zaag (1990), “Điều tra về bảo quản khoai tây giống ở đồng bằng Bắc Bộ”, Một số kết quả nghiên cứu khoai tây (1986- 1990), NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 77- 82.
[5] Http://old.netmode.com.vn
[7] Vũ Triệu Mân (1986), Bệnh virus khoai tây, Nxb Khoa học và Kĩ thuật. [8] Vũ Triệu Mân (2007), Giáo trình bệnh cây chuyên khoa, NXB Nông nghiệp I, Hà Nội.
[9] Vũ Triệu Mân (2007), Giáo trình bệnh cây đại cương, NXB Nông nghiệp I, Hà Nội.
[10] Nguyễn Thị Kim Thanh, Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch (1994), “Một số kết quả về việc tạo củ giống khoai tây trong ống nghiệm in vitro”, Kết quả nghiên cứu khoa học trồng trọt 1992- 1993, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. [11] Trần Thanh Thu, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1988), “Tạo củ bi khoai tây sạch virus bằng kĩ thuật nuôi cấy mô in vitro” , Tạp chí Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp.
[12] Hƣơng Tú ( 2008), Vị thuốc từ củ khoai tây, http:// www.ykhoanet.com. [13] Vũ Hƣớng Văn (2007), Khoai tây đâu chỉ là thực phẩm, http:// www.suckhoe360.com.
[14] Phạm Thị Vân, Nguyễn Minh Hùng, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2009), “Phân lập và so sánh trình tự gen mã hoá cho protein vở (CP) của PVY ở một số tỉnh thuộc đồng bằng sông hồng, Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, 1(31), tr 85-91.
[14] Trƣơng Quang Vinh (2007), Phân tích đa hình ADN và ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô thực vật vào việc nhân giống khoai tây củ bi sạch bệnh, Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm-Đại học Thái Nguyên.
Tài liệu nƣớc ngoài
[15] Abdelmaksoud H.M., Gamal Eldin A.S. (2002), The complete nucleotide sequence of the Potato virus Y strain N-Egypt, unpublished (GenBank Accession number: AF522296).
[16] Berckx R. (1967), “Methodische untersuchungen uber den serologischen nachweis pflanzenpathogener viren mit dem bentonitflockungstest, den latex- text und dem bariumsulfat test”, Phytopathologische Zeitschrift, 58, 1–17. [17] Bhat A.I., Varma A., Pappu H.R., Rajamannar M., Jain R.K., Praveen S. (2004), Accession AF118153, Potato virus Y polyprotein gene, partial cds. http://www. ncbi.nlm.nih.gov.
[18] Bill B., Dean (1992), “Managing the potato production system”, Food product press, An impuin of Haworth pess, New York, London, Nozwood (Australia), pp. 31-32.
[19] Boonham N., Barker I. (1998), “Strain-specific recombinant antibodies to potato virus Y potyvirus”, J. Virol. Methods, 74 (2), 193–199.
[20] Boonham N., Walsh K., Preston S., North J., Smith P., Barker I. (2002), “The detection of tuber necrotic isolates of Potato virus Y, and the accurate discrimination of PVY(O) PVYN and PVYC strains using RT-PCR”, J. Virol. Methods, 102 (1–2), 103–112.
[21] Bravo-Almonacid F., Mentaberry,A.N. (2006), Accession X14136, Potato virus Y (PVY) mRNA for viral coat protein. http://www. ncbi.nlm.nih.gov. [22] Chachulska A.M., Chrzanowska M., Robaglia C., Zagorski W. (1996),
Accession Z70237, Potato virus Y mRNA for coat protein. http://www. ncbi.nlm.nih.gov.
[23] Chachulska,A.M., Chrzanowska,M., Robaglia,C., Zagorski,W. (1996),
Accession Z70239, Potato virus Y mRNA for coat protein. http://www. ncbi.nlm.nih.gov.
[24] Chikh Ali M. et al., (2001), Virus gense, 35 : 359-367.
[25] Chrzanowska M. (1991), “New isolates of the necrotic strain of potato virus Y (PVYN) found recently in Poland”, Potato Res, 34, 179–182.
[26] Clark M.F., Adams A.N. (1977), “Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunoassay for the detection of plant viruses”, J. Gen. Virol, 34, 475–783.
[27] Dhar A.K., Singh R.P., Boucher A. (2002), Accession U91747, Potato virus Y polyprotein gene, partial cds, coat protein region. http://www. ncbi.nlm.nih.gov.
[28] Dimitre S. Mollov, Christian A. Thill* (2004), “Evidence of Potato Virus Y Asymptomatic Clones in Diploid and Tetraploid Potato-breeding Populations”, Potato Res (2004), 81:317-326 317.
[29] Ellis P., Stace-Smith R., Bowler G., Mackenzie D.J. (1996), “Production of monoclonal antibodies for detection and identification of strains of potato virus Y”, Plant Pathol, 18, 64–70.
[30] FAO (2005), FAO statistic database.
[31] Glais L., Kerlan C., Robaglia C. (2001), “Variability and evolution of potato virus Y, the type species of the Potyvirus genus”, Plant Viruses as Molecular Pathogens, Food Products Press, The Haworth Press Inc., New York.
[32] Gow L.J., Boonham N., Barker I., Foster G.D. (2006), Accession EF016294, Potato virus Y strain NTN isolate v942490, complete genome. http://www. ncbi.nlm.nih.gov.
[33] Gugerli P., Fries P. (1983), “Characterization of monoclonal antibodies to potato virus Y and their use for virus detection”, J. Gen. Virol, 64, 2471–2477. [34] Ha C., Revill P., Harding R.M., Vu M., Dale J.L. (2008), Accession DQ925437, Potato virus Y isolate PVY-VN/P2 polyprotein gene, partial cds. http://www. ncbi.nlm.nih.gov.
[35] Health R., Sward R.J., Moran J.R., Mason A.J., Hallam N.D. (1987), “Biological characterization of six Australian isolates of potato virus Y and their serological detection by ELISA”, Aust. J. Agric. Res, 38, 395–402.
[36] Hidaka M., Yoshida Y., Masaki H., Namba S., Yamashita S., Tsuchizaki T., Uozumi T. (2008), Accession D12539, Potato virus Y gene for polyprotein, partial cds. http://www. ncbi.nlm.nih.gov.
[37] Inoue-Nagata A.K., Fonseca M.E.N., Lobo T.O.T.A., de Avila A.C., Monte D.C. (2001), Accession AF255660, Potato virus Y isolate PVY-NBR polyprotein gene, partial cds. http://www. ncbi.nlm.nih.gov.
[38] Jakab G., Droz E., Brigneti G., Baulcombe D., Malnoe P. (1997), “Infectious in vivo and in vitro transcripts from a full-length cDNA clone of PVY-N605: a Swiss necrotic isolate of potato virus Y”, J. Gen. Virol, 78 (12), 31.
[39] Jakab G., Droz E., Brigneti G., Baulcombe D., Malnoe P. (2005),
Accession X97895, Potato virus Y genes encoding viral polyprotein. http://www. ncbi.nlm.nih.gov.
[40] Kerlan C (2008), Potato Viruses, @ 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved.
[41] Kerlan C, Moury B (2008), Potato virus Y, @ 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved
[42] Kerlan C., Tribodet M., Glais L., Guillet M. (1999), “Variability of potato virus Y in potato crops in France”, J. Phytopathol, 147, 643– 651. [43] Le Romancer M., Kerlan C., Nedellec M. (1994), “Biological characterization of various geographical isolates of potato virus Y inducing superficial necrosis on potato tubers”, Plant Pathol, 43, 138–144.
[44] Maat D.Z., Huttinga H. (1987), “Serology”, Viruses of Potatoes and Seed-Potato Production, Pudoc, Wageningen, NL.
[45] Macdec P. (1963), “Tuber forming substances in the potato”, The Growth of the potato, pp. 121- 130.
[46] Marie-Jeanne Tordo V., Chachulska A.M., Fakhfakh H., Le Romancer M., Robaglia C., Astier-Manifacier S. (1995), “Sequence polymorphism in the 5 NTR and in the P1 coding region of potato virus Y genomic RNA”, J. Gen. Virol, 76, 939–949.
[47] Matousek J., Ptacek J., Dedic P., Schubert J. (2000), “Analysis of variability of P1 gene region of N strain of potato virus Y using temperaturegradient gel electrophoresis and DNA heteroduplex analysis”,
Acta Virol, 44 (1), 41–46.
[48] Mc Donald J.G., Singh R.P. (1996), “Host range, symptomatology, and serology of isolates of Potato virus Y (PVY) that share properties with both the PVYN and PVYO strain groups”, Am. Potato J, 73, 309–315.
[49] Moravec T., Cerovska N., Boonham N. (2003), “The detection of recombinant, tuber necrosing isolates of Potato virus Y (PVYNTN) using a three-primer PCR-based in the coat protein gene”, J. Virol. Methods, 109 (1), 63–68.
[50] Nie X., Singh R.P. (2002), “A new approach for the simultaneous differentiation of biological and geographical strains of Potato virus Y by uniplex and multiplex RT-PCR”, J. Virol. Methods, 104 (1), 41–54.
[51] Nie X., Singh R.P. (2003), “Specific differentiation of recombinant
PVY(N:O) and PVY(NTN) isolates by multiplex RT-PCR”, J. Virol. Methods, 113
(2),69–77.
[52] Ohshima K., Sako K., Hiraishi C., Nakagawa A., Matsuo K., Ogawa T.,