Chúng tôi sử dụng vector tách dòng pBT do Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp để tiến hành phản ứng ghép nối và biến nạp.
Sản phẩm RT-PCR sau khi tinh sạch đƣợc gắn vào vector pBT bởi enzyme T4 ligase. Phản ứng ghép nối dựa trên nguyên tắc bổ sung giữa hai đầu nucleotide A thò ra ở sản phẩm PCR với Taq polymerase và hai đầu nucleotide T trên vector tách dòng. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ để phản ứng xảy ra hoàn toàn. Vector tái tổ hợp sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α và đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung ampicillin 100mg/l, X-gal 40mg/ml và IPTG 100M. Ủ đĩa petri ở 370C trong 16 giờ.
Thành công của thí nghiệm này phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, nhƣng có 2 yếu tố quan trọng nhất:
+ Sản phẩm PCR phải đặc hiệu, chất lƣợng tốt.
+ Tế bào khả biến phải đƣợc chuẩn bị tốt mới đạt đƣợc hiệu suất biến nạp cao nhất.
Chúng tôi đã thu đƣợc một lƣợng lớn khuẩn lạc gồm cả khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng. Các khuẩn lạc xanh có thể mọc lên từ tế bào nhận đƣợc plasmid tự đóng vòng trở lại nên gen lac-operon hoạt động tổng hợp enzyme β-galactosidase. Enzyme này sẽ chuyển hoá cơ chất X-gal thành hợp chất có màu xanh dƣới sự cảm ứng của IPTG. Còn những khuẩn lạc trắng xuất hiện là do vi khuẩn nhận đƣợc plasmid mang lac-operon không hoạt động, enzyme β- galactosidase không đƣợc tạo nên không có quá trình chuyển hoá X-gal thành dạng màu xanh. Lac-operon bị bất hoạt có thể do đoạn gen ngoại lai xen vào giữa promotor của operon gen LacZ làm cho lac-promotor không thể điều khiển quá trình tổng hợp enzyme. Đoạn gen ngoại lai có thể là đoạn gen CP- PVY nguyên vẹn hoặc cũng có thể là những đoạn bị đứt gãy. Các khuẩn lạc trắng có thể là những khuẩn lạc vệ tinh không mang plasmid. Khuẩn lạc vệ tinh có kích thƣớc nhỏ, đƣợc mọc lên xung quanh các khuẩn lạc có plasmid chứa đoạn gen xen vào sau khi khuẩn lạc này đã phân huỷ đáng kể lƣợng kháng sinh trong môi trƣờng xung quanh.
Để nhân đƣợc dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen CP cần phải tiến hành chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng cách PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) để loại bỏ các trƣờng hợp không mong muốn.