1.3.6.1. Thiệt hại PVY gây ra trên khoai tây
Ở khoai tây, hiện nay PVY đã trở thành virus nghiêm trọng nhất, gây thiệt hại lớn về kinh tế. Nó ảnh hƣởng tới hầu hết các cây và gây thiệt hại về sản lƣợng tới 80%, thậm chí còn lớn hơn trong trƣờng hợp bệnh đốm chết hoại củ khoai tây (PTNRD). Kết quả nghiên cứu những năm trƣớc, Weideman (1979) cho biết, ở Đức khi bị PVY nặng, khoai tây có thể giảm tới gần 60% năng suất dự thu.
Thiệt hại do PVY gây ra trên khoai tây phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó hai yếu tố quan trọng nhất là giống khoai tây và chủng virus.
1.3.6.2. Các chủng và các biến thể của PVY khoai tây
PVY khoai tây đƣợc chia thành 3 chủng (PVYO, PVYN và PVYC), nhiều biến thể. PVYO
, PVYN và PVYC đƣợc phân biệt dựa trên các phản ứng của chúng trên cây thuốc lá Nicotiana tabacum và trên khoai tây trồng mang các „hypersensitivity gene’ Nytbr và Nc (Kerlan, 2008) [40]. PVYN khác với PVYO và PVYC trong việc gây ra phản ứng chết hoại gân lá của N. tabacum cv Samsun hoặc cv Xanthi. 2aa ở vị trí 400 và 419 trong protein HC- Pro liên quan tới sự cảm ứng phản ứng chết hoại này ở cây thuốc lá. Ngoài ra, các chủng PVY còn đƣợc phân biệt bởi phản ứng trên cây chủ P. floridance. PVYC gây ra sự suy sụp và chết sớm ở loại cây này (Kerlan và cs, 2008) [41].
Các biến thể PVYNTN
, PVYNW và PVYN:O cũng khá phổ biến. PVYNW, PVYN:O và phần lớn PVYNTN là sự tái tổ hợp giữa chủng PVYO và PVYN với từ một đến ba điểm tái tổ hợp. PVYNTN
đặc trƣng bởi sự gây ra chết hoại củ trên khoai tây. Việc phát hiện ra PVYNTN
rằng cấu trúc tái tổ hợp của genome không phải là điều kiện quyết định cần thiết cho kiểu hình chết hoại củ. PVYN W phân biệt với PVYN
ở tính chất gây độc và kiểu huyết thanh là O-C. PVYN:O đƣợc mô tả trong những năm 2000 cũng mang một phần thuộc tính của PVYN
và PVYO. Một số PVYN:O
gây ra sự chết hoại củ (Kerlan, 2008) [40], (Kerlan và cs, 2008) [41], (Tetsuji Ogawa, 2008) [66].
Các chủng PVYO
và PVYN phân bố rộng khắp, nhƣng đến nay, PVYN vẫn chƣa thuộc danh sách mầm bệnh kiểm dịch ở Canada và USA. Chủng PVYC ít gặp hơn (ở Pháp PVYC chiếm ít hơn 5% PVY). Biến thể PVYNTN
đƣợc tìm thấy trong hầu hết các nƣớc trồng khoai tây kể cả USA và Peru. Còn biến thể PVYNW đƣợc thông báo ở một vài quốc gia và phổ biến ở Poland. Ở Canada và USA cùng thông báo sự xuất hiện của PVYN:O
.
Hình 1.6. Dấu hiệu so sánh PVY trên Nicotiana tabacum cv Xanthi (sau 15 ngày tiêm): (a) Thuốc lá nhiễm PVYN; (b) Thuốc lá nhiễm PVYO 1.3.6.3. Triệu chứng của bệnh do PVY trên khoai tây
Ba chủng (PVYO
, PVYN, PVYC) gây ra các triệu chứng khác nhau ở cây khoai tây:
+ PVYO: Khi lây nhiễm lần đầu (primer), phản ứng của cây với chủng virus này phụ thuộc vào giống khoai tây. Lá cây có thể chết hoại, tạo đốm hay ngả vàng, lá rũ xuống, đôi khi cây non bị chết. Lúc đầu các lá non xuất hiện
vết đốm hay vết hình khuyên, sau đó chết và treo trên thân, lá cây giòn (Vũ Triệu Mân, 1986) [6]. Khi nhiễm lần hai (secondery), triệu chứng điển hình là khảm, quăn, đốm chết hoại của lá và sự còi cọc của cây.
+ PVYN gây ra các triệu chứng nhẹ hơn, thƣờng là khảm, đốm trên lá. Đôi khi những vết đốm không rõ ở lần nhiễm đầu tiên. Khi bệnh nhiễm vào cây chậm, triệu chứng ở tán lá có thể không biểu hiện, nhƣng củ thu hoạch ở nhóm cây nhiễm chậm vẫn có thể mang bệnh (Vũ Triệu Mân, 1986) [6].
+ PVYC gây ra các sọc chấm trên thân và những đốm nâu xung quanh các mắt củ.
Bệnh đốm chết hoại củ khoai tây (PTNRD) do PVYNTN
và một số PVYNW, PVYN:O đƣợc đặc trƣng bởi những kiểu đặc biệt trên lá và thân (đôi khi là chết hoại lá sồi) sự chết hoại hình vòng và cong trên bề mặt củ. Đầu tiên, nó nhô ra không đáng kể trên vỏ củ, rồi trở nên nâu đen cùng một số vết rạn nứt (Kerlan và cs, 2008) [41].
Hình 1.7. Triệu chứng nhiễm lần hai (secondary) với PVY trên cánh đồng khoai tây: quăn, vàng và nhỏ của lá
Hình 1.8. Triệu chứng của bệnh đốm chết hoại củ khoai tây (PTNRD): (a)Vàng và chết hoại trên lá cơ bản; (b) Kiểu chết hoại lá sồi trên lá trung gian; (c) Triệu chứng điển hình của PTNRD trên củ ở cv Monalisa; (d) Triệu chứng không điển hình gây
ra bởi PVYO
trên củ ở cv Yukon Gold.
(Theo: K. Charlet-Ramage, GNIS-INRA, France (a–c) và R. P. Singh Potato Research Centre, NB, Canada (d)) 1.3.6.4. Biện pháp phòng chống bệnh do PVY gây ra trên khoai tây
Các bệnh do PVY gây ra trên khoai tây đƣợc phòng chống dựa trên các biện pháp quản lí khoai tây giống, gây giống kháng bệnh và các quy định về kiểm dịch, đặc biệt là đối với PVYN. Sự sản xuất khoai tây giống an toàn gồm: kiểm tra rệp truyền bệnh, xử lí dầu vô cơ chống lại sự truyền của rệp, trừ cỏ dại, kiểm tra phát hiện virus trong vụ thu hoạch chính bằng sử dụng ELISA trên phạm vi rộng. Nhiều các thí nghiệm sinh học phân tử cũng đƣợc phát triển để phát hiện PVY trong lá, củ và rệp nhƣ lai cDNA (cDNA hybridization), các RT-PCR khác nhau, kĩ thuật microarray. HR và ER lần lƣợt do các gen trội đơn NyvàRy quy định. Gen Ry (Rysto, Ryadg)ở loài họ cà
dại, nằm trên nhiễm sắc thể XI và XII, quy định khả năng kháng rộng. Ngƣợc lại, gen Nc, Nytbr nằm trên nhiễm sắc thể thứ IV và Nz lần lƣợt quy định khả năng kháng PVYC
, PVYO và PVYZ. Protein NiaPro của PVY liên quan tới việc hoạt động của Ry. Đã tạo đƣợc hơn 20 loại cây trồng chứa Ry đem lại khả năng kháng virus khá bền (Kerlan và cs, 2008) [41]. Ngoài ra, hƣớng nghiên cứu sử dụng vật liệu di truyền có nguồn gốc từ virus để tạo cây chuyển gen kháng virus đang đƣợc nhiều tác giả quan tâm.
Hình 1.9. Vị trí các gen kháng PVY trên genom khoai tây (Theo: S. Marchadour, FNPPPT-INRA, Pháp)
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU PVY TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.4.1. Tình hình nghiên cứu PVY trên thế giới
Năm 1931, Smith lần đầu tiên phát hiện ra PVY trên khoai tây. Từ đó đến nay, hàng loạt các công trình nghiên cứu về virus này đã đƣợc công bố. Các chủng và các biến thể PVY đƣợc phát hiện, nghiên cứu tỉ mỉ, thiệt hại của bệnh, các phƣơng pháp chuẩn đoán cũng nhƣ các biện pháp phòng chống PVY đƣợc đƣa ra.
Việc chẩn đoán các chủng PVY đầu tiên dựa vào các thí nghiệm sinh học. Các chủng khác nhau biểu hiện các triệu chứng khác nhau trên cây chỉ thị. Tuy vậy, phƣơng pháp này tốn nhiều thời gian, nhiều khâu phức tạp, không phù hợp với chuẩn đoán nhanh trên quy mô lớn. Vì vậy, nhiều nhóm nghiên cứu ở các phòng thí nghiệm quốc tế đã cố gắng phát triển các phƣơng pháp khác để phát hiện, mô tả PVY dựa trên các đặc điểm sinh học, huyết thanh và phân tử của PVY.
Từ cuối những năm 1970, những hiểu biết về thuộc tính gây miễn dịch của PVY đã đƣợc sử dụng trong việc nhận dạng virus. Dựa trên phản ứng kháng nguyên-kháng thể này, nhiều phƣơng pháp chuẩn đoán lần lƣợt đƣợc công bố nhƣ: DAS-ELISA hoặc TAS-ELISA (double-or triple-antibody Sandwich-enzyme-linked immunosorbent assays); sử dụng kháng thể đơn dòng hay đa dòng (Gugerli và Fries, 1983 [33]; Maat và Huttinga, 1987 [44]; Oshima và cs, 1990 [53]; Sanz và cs, 1990 [60]; Singh và cs, 1993 [62]; Ellis và cs, 1996 [29]); kính hiển vi điện tử hấp thụ miễn dịch immunosorbent electron microscopy (Walkey và Webb, 1984 [70]); chất kết dính nhựa mủ
latex agglutination (Berckx, 1967 [16]; Talley và cs, 1980 [65]). Tuỳ theo sự đặc trƣng của những kháng thể đƣợc sử dụng mà sự kiểm tra này có thể có phổ rộng (Health và cs, 1987 [35]; Ellis và cs, 1996 [29]), hay chỉ phân biệt đƣợc giữa PVYN
với PVYO hoặc với PVYC (Mc Donald và Singh, 1996 [48]; Boonham và Barker, 1998 [19]; Ounouna và cs, 2002 [54]). Phƣơng pháp huyết thanh nhanh, đáng tin cậy cho việc nhận dạng PVYN
và PVYO và phƣơng pháp này đƣợc sử dụng khá phổ biến để phát hiện virus trong lá cây (Clark và Adams, 1977 [26]) hay trong các mô khác nhƣ củ khoai tây (Vetten và cs, 1983 [69]). Tuy nhiên, gần đây sự nổi lên của các biến thể nhƣ PVYNTN (Le Romancer và cs, 1994 [43]; Kerlan và cs, 1999 [42]) và PVYNW đã cho thấy điểm hạn chế của phƣơng pháp huyết thanh (Chrzanowska, 1991 [25]). Bằng phƣơng pháp sử dụng kháng thể đơn dòng, đa dòng đã xếp PVYN
nhóm PVYO, mặc dù chúng rõ ràng gây ra triệu chứng chết hoại trên gân thuốc lá. Ngoài ra, phƣơng pháp này không phân biệt đƣợc PVYNTN
và PVYN. Sự phát triển của kĩ thuật sinh học phân tử từ đầu những năm 1980 cho phép nghiên cứu tính đa dạng di truyền của PVY. Những nghiên cứu sử dụng bản đồ RFLP của một phần hay toàn bộ genome đã đƣợc tiến hành. Toàn bộ trình tự của PVYN
(Robaglia và cs, 1989 [56]; Jakab và cs, 1997 [38]; Abdelmaksoud và Gamal Eldin, 2002 [15]; Nie và Singh, 2003 [51]), PVYO, PVYNTN (Thole và cs, 1993; Nie và Singh, 2003 [51]) đã đƣợc công bố. Hơn nữa, trình tự vùng không dịch mã (NTR) ở đầu 5‟ và đầu 3‟, các gen của PVY đã có sẵn trong ngân hàng gen. Những dữ liệu này cho phép so sánh giữa các trình tự, xác định sự tƣơng đồng hay khác biệt về trình tự giữa các virus. Những nghiên cứu này đã chỉ ra rằng:
+ Tính biến đổi cao của PVY (trên 28% khác nhau giữa vùng P1 của PVYN và PVYO (Marie-Jeanne Tordo và cs, 1995 [46])).
+ Sự tƣơng đồng giữa trình tự coat protein (CP) của PVYN
W và PVYO. Điều này đã giải thích việc phát hiện PVYNW bởi các kháng thể đơn dòng đặc trƣng của PVYO
.
+ Sự có mặt của 1 (PVYNW) đến 3 (PVYNTN) điểm tái tổ hợp giữa trình tự của PVYN
và PVYO trong các biến thể PVY nổi lên gần đây.
Nhƣ một sự thay thế cho phƣơng pháp huyết thanh, nhiều thí nghiếm sinh học phân tử đặc hiệu và nhạy cảm đƣợc phát triển dựa trên sự biến đổi trong trình tự PVYN
, PVYO hay điểm tái tổ hợp ở bên trong genome nhằm phát hiện đặc hiệu các chủng và biến thể của PVY. Có thể kể đến các phƣơng pháp nhƣ: gel retardation (Rosner và Maslenin, 2001, 2003 [58] [59]; Matousek và cs, 2000 [47]); RT-PCR-RFLP (Glais và cs, 2002 [31]); single-restriction cleavage of PCR products (Rosner và Maslenin, 1999 [57] ); RT-PCR đơn thành phần (Nie và Singh, 2002 [50]; Boonham và cs, 2002 [20]); RT-PCR đa thành phần
(Nie và Singh, 2002 [50]); AmpliDet RNA; competitive fluorescent RT-PCR (Walsh và cs, 2001 [71]) và PCR 3 mồi (Moravec và cs, 2003 [49]).
Sử dụng vật liệu di truyền của virus để tạo cây khoai tây chuyển gen là một hƣớng đi mới, đã và đang nhận đƣợc những kết quả khá khả quan. Schubert và cs, 2004 đã tạo thành công khoai tây chuyển gen Nib kháng PVY.
1.4.2. Tình hình nghiên cứu virus PVY ở Việt Nam
Ở nƣớc ta, những nghiên cứu về bệnh virus nói chung và bệnh PVY nói riêng trên khoai tây còn rất ít. Việc nghiên cứu mới bắt đầu dừng lại ở phát hiện sự xuất hiện của bệnh, sự phân bố của bệnh trên các cánh đồng khoai tây, tỉ lệ nhiễm, thiệt hại và phản ứng của cây khi bị nhiễm virus. Cũng có những nghiên cứu xác định loại và chủng virus, nhƣng dựa trên các phƣơng pháp quan sát bằng mắt thƣờng, cây chỉ thị, huyết thanh, kính hiển vi điện tử (Vũ Triệu Mân, 1986) [6].
Với sự tiến bộ của công nghệ sinh học đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô để nhân giống khoai tây củ bi sạch bệnh Nguyễn Thị Kim Thanh và cs, 1994) [9], (Trần Thanh Thu và cs, 1988) [10], (Trƣơng Quang Vinh, 2007) [14].
Đến nay, vẫn chƣa có nhiều nghiên cứu áp dụng kĩ thuật sinh học phân tử trong phân tích, đánh giá đặc điểm di truyền của PVY khoai tây đƣợc công bố (Phạm Thị Vân và cs, 2009) [13].
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Các mẫu lá khoai tây có triệu chứng bị nhiễm bệnh đƣợc thu từ một số vùng thuộc miền Bắc Việt Nam. Các mẫu nghiên cứu đƣợc thể hiện trong bảng sau:
Bảng 2.1. Danh sách các mẫu thu tại các điểm nghiên cứu
STT Địa điểm thu thập mẫu Kí hiệu
1 Phú Bình – Thái Nguyên Phú Bình
2 Phổ Yên – Thái Nguyên Phổ Yên
3 Văn Lâm – Hƣng Yên Hƣng Yên
4 Việt Yên - Bắc Giang Bắc Giang
5 Thái Thụy - Thái Bình Thái Bình
2.2. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 2.2.1. Hoá chất
- Bộ kit tách chiết RNA tổng số của hãng Invitrogen. - Bộ kit tổng hợp cDNA của hãng Fermentas.
- Bộ hoá chất sử dụng cho kĩ thuật PCR. - Bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR của Bioneer.
- Các hoá chất thông dụng phục vụ cho các kĩ thuật sinh học phân tử nhƣ agarose, cồn, X- gal, ampicilin…
2.2.2. Thiết bị
Máy li tâm, máy soi gel, bộ điện di, tủ cấy vô trùng, máy chụp ảnh, pipet, máy PCR, máy xác định trình tự nucleotit tự động và nhiều thiết bị khác.
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm đƣợc tiến hành tại:
+ Phòng thí nghiệm Di truyền học, khoa Sinh-trƣờng Đại học Sƣ phạm; Phòng thí nghiệm thuộc khoa Sinh-trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên.
+ Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Các thí nghiệm công bố trong luận văn đƣợc thể hiện qua sơ đồ sau:
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát
2.3.1. Phƣơng pháp thống kê
Tỉ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY đƣợc xác định theo phƣơng pháp thống kê. Trong mỗi khu vực nghiên cứu, lấy ngẫu nhiên 3 lô thí nghiệm. Mỗi lô có 100 khóm. Xác định số khóm có triệu chứng bị bệnh trong
Xác định tỉ lệ nhiễm, Thu thập mẫu bệnh Tách RNA tổng số Nhân gen CP Tách dòng gen Xác định và so sánh trình tự gen CP Khai thác trình tự trong NCBI
từng lô. Tỉ lệ khoai tây có triệu chứng bị bệnh ở mỗi vùng sẽ đƣợc tính bằng trung bình của tỉ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm bệnh trên 3 lô.
2.3.2. Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số
Chúng tôi đã sử dụng bộ kit Trizol Reagents (Invitrogen) để tách chiết RNA tổng số theo quy trình sau:
- Cân 100mg lá khoai tây có triệu chứng nhiễm bệnh, nghiền nhanh trong nitơ lỏng, đảm bảo mẫu phải đƣợc nghiền triệt để và tránh enzyme RNase cắt RNA.
- Chuyển ngay mẫu vào ống eppendorf 2ml.
- Bổ sung 1ml Trizol Reagents, đảo đều ở nhiệt độ phòng (15-300C) trong 5 phút.
- Bổ sung 200µl Chloroform: Isoamyl (24:1). - Đảo đều ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. - Ly tâm 10000 vòng/phút trong 15 phút.
- Hút 500 dịch nổi, chuyển sang ống eppendorf 1,5ml.
- Bổ sung 500µl Isopropanol đã đƣợc làm lạnh đến 40C, lắc nhẹ ống để RNA kết tủa.
- Để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, ly tâm 10000 vòng/ phút trong 15 phút.
- Loại bỏ dịch nổi, rửa tủa RNA bằng cồn 700 pha trong DEPC 0,01%. - Ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút.
- Làm khô RNA bằng máy Speed Vac trong khoảng 3 phút. - Pha loãng RNA trong 40µl H2O đã xử lí DEPC 0,01%. - Ủ ở nhiệt độ 550C trong 5 phút để RNA tan hết.
Do RNA dễ bị RNase cắt nên tất cả các dụng cụ đều phải xử lí DEPC 1% và khử trùng trƣớc khi sử dụng.
2.3.3. Phƣơng pháp RT-PCR
Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) là sự kết hợp của hai phản ứng: sao mã ngƣợc (reverse transcription) tạo cDNA và PCR để nhân một đoạn gen quan tâm từ cDNA.
Kỹ thuật RT-PCR để nhân gen CP đƣợc tiến hành theo hai bƣớc sau:
Bước 1: Tổng hợp cDNA
- Bổ sung lần lƣợt các thành phần sau đây vào ống eppendorf 0,5ml đã đƣợc xử lí DEPC 1% hoặc Rnase:
Thành phần Thể tích
250ng mồi ngẫu nhiên 2µl
10pg - 5µg RNA tổng số 2µl
dNTPs 10mM 2µl
- Bổ sung nƣớc DEPC 0,01% tới thể tích 13µl. - Ủ ở 650C trong 5 phút, sau đó đặt vào đá.
- Tiếp tục bổ sung các thành phần sau vào ống phản ứng:
Buffer 5X 4µl
DTT 0,1M 1µl
Rnase OUTTM (40 đơn vị/µl) 1µl
Cloned AMV RT (15 đơn vị/µl) 1µl
- Trộn mẫu nhẹ nhàng, sau đó thực hiện một chu kì nhiệt nhƣ sau:
Bƣớc Nhiệt độ (0 C) Thời gian (phút) 1 25 10 2 45 50 3 85 5 4 4 ∞
Bước 2: Phản ứng PCR
Sau khi tổng hợp cDNA, tiến hành chạy PCR với cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại gen CP. Thành phần, chu kì nhiệt cho phản ứng PCR đƣợc trình bày trong bảng 2.2 và bảng 2.3. Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nƣớc cất khử ion, khử trùng 12,5 2 Dung dịch đệm 10X 2,5 3 MgCl2 (25mM) 2,5 4 dNTPs (10mM) 2 5 Mồi xuôi 1 6 Mồi ngƣợc 1
7 Taq polymerase (1U/1µl) 0,5