Virus rất nhỏ bé, chỉ cĩ thể quan sát được dưới kính hiển vi điện tử. Chúng chưa cĩ cấu trúc tế bào nên bắt buộc phải kí sinh nội bào trên cơ thể một sinh vật khác (vi khuNn, nấm, động vật, thực vật). Chúng chỉ cĩ cấu tạo bởi một vỏ protein bao bọc bên ngồi một lõi acid nucleic. Chúng cĩ đầy đủ các hoạt động sống như di truyền, biến dị, tăng trưởng, sinh sản truyền nhiễm… mặc dù các hoạt động này đều phải gắn liền với tế bào vật chủ.
Virus thực vật đã được phát hiện cách đây trên một thế kỷ và thu hút được sự
quan tâm của nhiều nhà sinh học. Ngành nơng nghiệp hết sức lúng túng trước các bệnh nghiêm trọng do virus gây nên vì cho đến nay vẫn chưa cĩ thuốc phịng trừđặc hiệu (bệnh khảm thuốc lá, bệnh xoăn lá cà chua, bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá ở lúa…).
Cây bị bệnh virus cĩ thể tàn lụi, chết. Một số bộ phận của cây như thân, hoa, củ, quả, lá bị hủy hoại, cây phát triển kém dẫn tới năng suất giảm, chất lượng nơng sản về dinh dưỡng, cảm quan kém. Một số trường hợp bệnh hại cây cĩ thể sinh ra những độc tố gây ảnh hưởng xấu, trực tiếp đến sức khoẻ và đời sống của con người và động vật.
Do tác hại của virus vơ cùng to lớn nên cần cĩ những biện pháp chuNn đốn và phát hiện sớm để cĩ biện pháp sử lý cho thích hợp. Hiện nay cĩ nhiều phương pháp chuNn đốn bệnh virus thực vật như phương pháp huyết thanh (trong đĩ phương pháp DAS-ELISA là phương pháp huyết thanh hiện đại nhất), phương pháp cây chỉ thị, phương pháp chuNn đốn bằng hiển vi điện tử, chuNn đốn phân tử (RT-PCR).
Phương pháp ELISA tới nay vẫn là phương pháp phát hiện virus hiệu quả, nhanh chĩng được sử dụng rộng rãi. Để thực hiện được phương pháp này cần phải tách được protein của virus thực vật, bằng cách nghiền mẫu thực vật cĩ chứa virus trong dung dịch đệm nhằm giữ pH khơng đổi ở dịch chiết và thực hiện quy trình làm tinh khiết virus.
ELISA là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất để xác định kháng thểđặc hiệu chống virus ở thời điểm xuất hiện triệu chứng hoặc ngay sau khi xuất hiện triệu chứng. Kỹ thuật cho phép xác định kháng thể ở nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 µg/ ml). Nguyên lý phương pháp này là kháng thể được đánh dấu bằng cách gắn với enzym. Khi cơ chất thích hợp enzym sẽ phân giải, cơ chất cho sản phNm cĩ màu. Đo cường
độ màu để biết mức độ phản ứng xảy ra.
Kỹ thuật ELISA được dùng nhiều là kỹ thuật “bánh kẹp”(sandwich), theo đĩ kháng nguyên của cây bệnh (virus) được phản ứng với kháng thể sơ cấp đã biết, được xác định khi cho thêm kháng thể thứ cấp cĩ gắn enzym.
Các bước thực hiện như sau:
- Cốđịnh kháng thể sơ cấp (đã được biết) lên thành giếng
- Nạp dịch virus (kháng nguyên) vào giếng rồi ủ. Nếu kháng nguyên phù hợp sẽ
tạo phản ứng với kháng thể sơ cấp. Rửa nhẹđể loại bỏ kháng nguyên thừa.
29
- Thêm cơ chất thích hợp với enzym. Cường độ màu tỷ lệ thuận với lượng kháng nguyên trong dịch chiết virus.
4.1. Bệnh khảm thuốc lá TMV (tobacco mosaic virus)
TMV là bệnh virus phổ biến ở các vùng trồng thuốc lá trên thế giới. Ở Việt Nam bệnh gây hại nặng trên vùng trồng thuốc lá các tỉnh đồng bằng và trung du Bắc bộ. Cây bị nhiễm bệnh cĩ thể giảm năng suất 35%, chất lượng thuốc lá cũng giảm mạnh do hàm lượng nicotine giảm, lá dễ bị gãy nát.
Virus cĩ khả năng truyền bệnh cao. Bệnh truyền chủ yếu qua con đường tiếp xúc cơ học, các vết thương do xây xát. Virus vận chuyển trong cây theo hệ thống mạch dẫn.
Bệnh Khảm thuốc lá cĩ khả năng gây hại cho nhiều cây khác ngồi thuốc lá như cây ớt, cà chua, địa lan, hoa cúc...
4.2. Bệnh khảm thuốc lá trên địa lan
Cây bệnh nhiễm hệ thống, gây hiện tượng khảm lún cây, cây cịi cọc, xuất hiện các vết chết hoại ở phần lá, trên lá non xuất hiện các lá xanh, vàng phiến lá nhỏ
hẹp, ,mặt lá sầm sùi. Các tế bào biểu bì trên phần sáng của vết bệnh nhỏ hẹp, xếp sít nhau, ở phần xanh lam của vết bệnh tế bào biểu bì lớn hơn.
4.3. Bệnh khảm thuốc lá trên cúc
Trên lá non xuất hiện các lá xanh, vàng xen kẽ nhau, gân lá nhợt nhạt, lá nỏ
hẹp, cây chỉ bằng ½ cây khỏe, cây mất triệu chứng khi nhiệt độ giảm xuống 110C. Cây nhiễm bệnh hệ thống.
Gây bệnh cho Cúc, Lan bao gồm nhiều yếu tố và nhiều nhĩm vi sinh vật khác nhau. Trong báo cáo này chúng tơi chỉ tiến hành test và đánh giá tác hại của virus TMV. Bởi vì, TMV là một virus phổ rộng, đồng thới khơng phải là virus gây hại chính cho các đối tượng trên. Do đĩ nếu các đối tượng trên nhiễm TMV thì xác suất nhiễm các bệnh virus khác rất cao.
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu: 2.2.1 Vật liệu ban đầu 2.2.1 Vật liệu ban đầu
Đặc thù của đề tài là nghiên cứu bảo tồn nguồn gen các giống cúc và hoa lan cắt cành hiện đang sản xuất tại Đà Lạt là sựđa dạng về giống, riêng giống cúc nhập vào Đà lạt đã cĩ hơn 70 giống. Chính vì vậy, trong phương pháp thực hiện nghiên cứu chúng tơi chỉ nêu những phương pháp chung và trên một số giống làm chuNn, các giống cịn lại đều tuân thủ theo các bước sau đây: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
a. Thu thập mẫu
b. Tách và nuơi cấy mơ phân sinh.
c. Nhân nhanh protocorm (đối với địa lan), nhanh nhanh cây cúc in vitro d. Chuyển protocorm và cây con sang mơi trường xử lý virus
e. Tách lại mơ phân sinh f. Nhân nhanh và test virus
2.2 Phương pháp nghiên cứu
A. Phương pháp áp dụng trên đối tượng lan Cymbidium
Các thí nghiệm đã tiến hành sử dụng protocorm của ba giống địa lan sẵn cĩ trong phịng thí nghiệm. Ba giống đĩ là Trắng bệch, Tím hột, và Miretta xanh. Cả ba gjống này đều cho hoa rất đẹp và các giống mà được trồng rộng rãi ởĐà Lạt.
1. Mơi trường nuơi cấy
Trong các thí nghiệm đã thực hiện với mơi trường khống Knudson C, MS và 1/2MS cĩ bổ sung thêm các chất khác là:
Vitamin: các vitamin là myo - inositol, acid nicotinic, pyridoxine HCl, Thiamin HCl. Đây là các vitamin được sử dụng trong mơi trường MS.
Peptone được bổ sung với hàm lượng 2g/l. Agar được bổ sung 8g/ l.
Chất điều hịa sinh trưởng bổ sung là BA: 0.5 mg/ l.
Đường saccharose với hàm lượng 30g/l.
2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.1. Nghiên cứu mơi trường dinh dưỡng thích hợp và sử dụng ribazole hổ trợ
31
Các protocorme hình thành sau khi qua bước nuơi cấy đỉnh dinh trưởng, chúng tơi tiếp tục bố trí nuơi cây trong các mơi trường cĩ hàm lượng khống MS, 1/2MS và mơi trường Knudson C.
Các thí nghiệm về tác động của của than hoạt tính, cytokinin (chọn BA), cytokinin/auxin (chọn BA và NAA) đều sử dụng mơi trường khống cơ bản là MS. Cách bố trí thí nghiệm như sau:
- Thí nghiệm ảnh hưởng của BA: Chúng tơi bố trí 5 nồng độ khác nhau: 0, 0.5, 1.0, 1.5 và 2 mg/l.
- Thí nghiệm ảnh hưởng phối hợp giửa BA và NAA: này được thực hiện bởi các protocorme nuơi cấy trong mơi trường MS, cĩ than hoạt tính là 1g/l, nồng độ BA là 1ml/l và cĩ bổ sung thêm các nồng độ NAA từ 0 – 2mg/l.
Chọn mơi trường thích hợp từ các thí nghiệm trên để tiếp tục nghiên cứu tác
động của ribazole lên sinh trưởng của cây con. Chúng tơi sử dụng ribazole trong các thí nghiệm với các nồng độ 0 mg/l, 50 mg/l, 75 mg/l, 100 mg/l và 150 mg/l. Dạng ribazole đã sử dụng là chế phNm của Getz Pharma.
Các protocorm tái sinh trên mơi trường đã xử lý ribazole, tiếp tục được cấy chuyền để theo dõi khả năng phục hồi và test virus. Cây sạch bệnh tiếp tục được nhân lên để giữ giống cũng như chuyển ra khảo nghiệm ở vườn ươm.
Các mẫu thí nghiệm trên được nuơi trong điều kiện phịng nuơi in- vitro với: Thời gian chiếu sáng: 10h/ ngày.
Cường độ chiếu sáng: 45 micro mol m-2 s-1
ĐộNm trung bình: 75- 80 % Nhiệt độ: 25- 27oC
Chỉ tiêu theo dõi:
Các chỉ tiêu được theo dõi là số mẫu cấy sống sĩt, số lượng protocorm mới phát sinh sau 60 ngày nuơi cấy. Bên cạnh đĩ một số chỉ tiêu khác thường xuyên được theo dõi là thời gian bắt đầu phát sinh protocorm mới, màu sắc mẫu cấy. Sau giai
đoạn xử lý, theo dõi các chỉ tiêu sinh trưởng của cây con (chiều cao, số lá, số rễ, trọng lượng tươi sau ba tháng cấy chuyền…)
2.2. Nghiên cứu giá thể thích hợp cho cây lan con khi ra vườn ươm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cây con sau khi rút khỏi mơi trường in vitro cần rửa sạch agar bám vào rễ, nhúng rễ cây con với Mancozeb rồi mới trồng vào giá thể.
Khay trồng: Khay kích thước 30 × 45 × 5cm
Với thí nghiệm giá thể: chúng tơi bố trí một số nghiệm thức sau: Ký hiệu loại giá thể Loại giá thể I II Dớn mút 3T
32 III IV V VI VII VIII 3T/dớn xay (1:1) Xơ dừa Dớn xay/Xơ dừa (3/1) Dớn xay/Xơ dừa (2/1) Dớn xay/Xơ dừa (1/1) Dớn xay
Số lượng cây con/ khay: 100 cây
ĐộNm giá thể: 70 – 80%
ĐộNm khơng khí: 90 – 95% Nhiệt độ nuơi trồng: 20-25oC Ánh sáng: Độ che sáng > 70% Số lần tưới/ngày: 3-5 lần
Bĩn phân: N-P-K tỉ lệ 3:1:1 pha lỗng cĩ EC 1.0 ds/m phun mỗi tuần 2 lần (trừ
tuần đầu tiên sau khi mới ra cây)
2.3. Nghiên cứu chếđộ phân bĩn cho cây con giai đoạn ra vườn ươm
Cây con sau khi rút khỏi mơi trường in vitro cần rửa sạch agar bám vào rễ, nhúng rễ cây con với Mancozeb rồi mới trồng vào giá thể. Giá thể được chọn ra từ
những kết quả nghiên cứu giá thểđể bố trí thí nghiệm. Khay trồng: Khay kích thước 30 × 45 × 5cm Số lượng cây con/ khay: 100 cây
ĐộNm giá thể: 70 – 80%
ĐộNm khơng khí: 90 – 95% Nhiệt độ nuơi trồng: 20-25oC Ánh sáng: Độ che sáng > 70% Số lần tưới/ngày: 3-5 lần
Bĩn phân: N-P-K tỉ lệ 3:1:1 pha lỗng cĩ EC thay đổi từ 0; 0.5; 1.0 và 1.5ds/m phun mỗi tuần 2 lần (trừ tuần đầu tiên sau khi mới ra cây)
B. Phương pháp áp dụng trên đối tượng hoa cúc
Với các giống cúc chúng tơi chọn các giống hoa cúc được trồng khá phổ biến ở Đà Lạt farm hồng, pingpong vàng, nút vàng, nút tìm, tia muỗng vàng. Các giống thu thập cịn lại đều theo một qui trình mẫu tương tự các giống nêu ra ởđây.
Trong đề tài chúng tơi sử dụng vật liệu ban đầu là các đế hoa, được lấy từ các vườn sản xuất của bà con nơng dân trong địa bàn thành phốĐà Lạt.
33 - Chọn đế hoa từ cây trồng trên vườn.
- Rửa bằng xà phịng và rửa lại bằng nước cất nhiều lần, đảm bảo sạch hết xà phịng.
- Khử trùng mẫu bằng TTCA với nồng độ 15g/l, trong 10 phút. Trong quá trình khử mẫu luơn lắc đều đặn, nhẹ nhàng đểđảm bảo các mẫu được khử trùng đều.
- Đưa vào điều kiện vơ trùng để rửa lại nhiều lần bằng nước cất (4-5 lần) , trước khi đưa vào nuơi cấy trong mơi trường MS+0.2mg/l IBA+0.5mg/l BA đã chuNn bị sẵn.
Đế hoa sau khi nuơi cấy 30 ngày, cĩ thể tiếp tục cấy chuyền trong mơi trường nhân nhanh (MS+0.2mg/l IBA+0.5mg/l BA) đểđảm bảo số lượng đỉnh chồi cần thiết cho thí nghiệm.
34
Mơi trường nuơi cấy
Mơi trường để nuơi cấy là mơi trường MS (Murashige – Skooge, 1962), bổ
sung 30g/l đường, 8g/l agar, chất điều hồ sinh trưởng gồm cĩ: 0.2mg/l IBA, 0.5mg/l BA; và được bổ sung Ribazole ở các nồng độ khác nhau.
Mơi trường nuơi cấy được điều chỉnh về pH =5.8 bằng KOH (1N), hoặc HCL (1N). Mơi trường nuơi cấy được đun cho hồ tan các thành phần trước khi khử trùng bằng autoclave ở nhiệt độ 1210C, 1 atm trong 30 phút.
Sau khi khử trùng, mơi trường được đổ vào bao nilon 500ml, chứa 100ml mơi trường. Bao nilon cũng đã được hấp vơ trùng trong autoclave ở nhiệt độ 1210C, 1 atm trong 30 phút. Quá trình đổ mơi trường vào bao nilon được tiến hành trong tủ cấy ở điều kiện vơ trùng. Bảng 2.1 :Thành phần cơ bản của mơi trường MS Thành phần Nồng độ (mg/l) Muối khống đa lượng CaCl2.2H2O 440 KH2PO4 170 KNO3 1900 MgSO4.7H2O 370 NH4NO3 1650 Muối khống vi lượng MnSO4.4H2O 22.3 ZnSO4.7H2O 8.6 H3BO3 6.2 KI 0.83 Na2MoO4.2H2O 0.25 FeSO4.7H2O 27.8 Na2EDTA 37.3 Cu SO4.5H2O 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 Vitamin và các thành phần hữu cơ Glyxin 2 Myo-inositol 100 Acid nicotinic (Niaxin) 0.5 Thiamin HCl (vitamin B1) 0.1 Pyridoxine HCl (vitamim B6) 0.5
35 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 2.2 :Thành phần cơ bản của mơi trường Knudson C (1946)
Ca(NO3)2 * 4 H2O 1000 mg KH2PO4 250 mg MgSO4 * 7 H2O 250 mg (NH4)2SO4 500 mg FeSO4 * 7 H2O 25 mg MnSO4 * 4 H2O 7.5 mg Sucrose 20 g Agar 12-15 g Phương pháp bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hồn tồn. Chọn mẫu cấy ban đầu (đế
hoa) cĩ kích thước tương đối đồng đều. Mỗi bao nilon được cấy 9 mẫu, lặp lại 3 lần. Sau khi cấy, các mẫu cấy được bố trí nuơi trong phịng cây, đảm bảo ánh sáng đồng
đều với thời gian chiếu sáng 16 giờ. Nhiệt độ trong khoảng 18-250C.
Phương pháp lấy chỉ tiêu và xử lý số liệu:
Sau thời gian nuơi cấy 30 ngày, chúng tơi tiến hành lấy số liệu gồm các chỉ
tiêu về số chồi/cụm chồi; chiều cao chồi (tính từ gốc đến ngọn) để nhận xét về mức
độ sinh trưởng và phát triển của cây dưới ảnh hưởng của Ribazole.
Số liệu được tính tốn trên phần mềm EXCEL phiên bản 2003, của Microsoft. Gồm cĩ tính các số liệu trung bình trong mỗi nghiệm thức và dùng cơng cụ data analysis để phân tích số liệu bằng bảng ANOVA.
Các thí nghiệm
- Ảnh hưởng của Ribazole lên sự sinh trưởng phát triển in vitro
Các cây in-vitro được nuơi cấy từ đế ban đầu, được dùng làm vật liệu cho thí nghiệm. Từ các đỉnh chồi tách ra từ cây in-vitro, theo từng giống, sẽđược cấy vào các lơ nghiệm thức khác nhau. Trên mỗi giống, các lơ thí nghiệm bao gồm:
Lơ nghiệm thức R0 R1 R2 R3 R4
Nồng độ (mg/l) 0 50 75 100 150
Sau 30 ngày nuơi cấy, các cây sẽđược đo đạc các chỉ tiêu: số chồi/cụm, chiều cao chồi và tỷ lệ sống.
Sự phục hồi của cây sau khi xử lý ribazole
Các cây sau khi đã xử lý ribazole, chúng tơi tiến hành tách đỉnh chồi, cấy chuyền lại trong mơi trường nhân nhanh bình thường, để kiểm tra sự phục hồi của cúc sau khi xử lý ribazole.
36
Do một sốđiều kiện khách quan, chúng tơi tiến hành kiểm tra sự phục hồi sau của cây cịn sống ở tất cả các nồng độ đối với ba giống (tia muỗng vàng, farm hồng và pingpong vàng); đối với hai giống cịn lại (nút vàng và nút tím) chúng tơi kiểm tra
ở lơ nghiệm thức R2 để so sánh với lơ đối chứng.
Các chỉ tiêu quan sát cũng bao gồm: số chồi/cụm, chiều cao chồi và tỷ lệ sống của mẫu cấy.
Phương pháp test virus
- Đối tượng là các cây hoa địa lan, hoa cúc cĩ triệu chứng nhiễm bệnh virus TMV điển hình theo mơ tả trên và các mẫu cây trong ống nghiệm được sử lý loại virus.
- Thời gian:
Đợt 1: 5//2006 – 6/2006
Đợt 2: 9/2007 - Địa điểm:
+ Thí nghiệm được tiến hành tại phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học thuộc khoa Sinh học- Đại học Đà Lạt
+ Mẫu vật lấy tại một số vườn trồng Cúc và lan trên địa bàn Phường 8 – Tp Đà Lạt và mẫu ở PNCM khoa Nơng Lâm
Bộ kít và máy ELISA (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Mondel 680 Microplate Reader S/N/14172 - Kit. name : Full kit 1000 Tests (Bio – rad)
Quá trình tiến hành