CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM CHẾ BIẾN SẴN.
3.6.1 Định tính E.coli trong thực phẩm
3.6.1.1 Ý nghĩa
Là chỉ tiêu đánh giá mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm trong chế biến, bảo quản, đặc biệt là khả năng nhiễm phân của thực phẩm.
3.6.1.2 Nguyên tắc
Đây là phương pháp dùng để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện
E.coli trong một lượng mẫu xác định.
Cấy mẫu vào môi trường tăng sinh BGBL, phân lập trên môi trường EMB và khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hoá (nghiệm pháp IMViC).
3.6.1.3 Thuyết mình quy trình
Chuẩn bị mẫu
Ủ ở 37 ± 0,5oC qua đêm
Kết luận: phát hiện (hay không phát hiện) E.coli trong 25g mẫu. Indol (+), MR (+), VP (-), Citratase (-)
Một trong những phản ứng trên sai thì không phải là E.coli
Cấy chuyển vào các môi trường thử nghiệm sinh hóa: Canh trypton, MR-VP, Simmon Citrate, để thử nghiệm IMViC
Cân 25g mẫu + 225 môi trường BPW đồng nhất 30 giây
Lấy 1ml mẫu trên vào 10ml môi trường BGBL
Chọn khuẩn lạc dẹt, có ánh kim, đường kính khoảng 1mm để cấy sang TSA Ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 giờ
Ủ ở 44 ± 0,5oC trong 24 – 48 giờ
Chọn các ống sinh hơi cấy sang EMB. Mẫu không sinh hơi được xem là âm tính với E.coli
Hình 3.9 : Khuẩn lạc E.coli trên môi trường EMB[12]
Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu được độ pha loãng 10-1.
Cấy mẫu
Tăng sinh: Cấy 1ml dịch mẫu có nồng độ 10-1 vào ống nghiệm có chứa 10ml môi
trường tăng sinh BGBL. Ủ trong 24 giờ ở 44oC
Phân lập: Chọn ống nghiệm có phản ứng dương tính làm đục môi trường và có sinh hơi trong ống durham. Cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa EMB, ủ trong 24 giờ ở 37oC. Nhận dạng khuẩn lạc đặc trưng E.coli: Khuẩn lạc tròn, dẹp,ánh kim tím, đường kính khoảng 0.5mm ( hình 3.9). Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa TSA, tăng sinh không chọn lọc.
Thử nghiệm khẳng định
Lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA cấy sang các môi trường thử nghiệm IMViC. Thực hiện như sau.
Thử nghiệm khả năng sinh indol: Cấy vi sinh vật qua môi trường canh Trypton ủ khoảng 24 giờ ở 37oC. Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s. Phản ứng dương (+) tính khi trên bề mặt có vòng đỏ cánh sen xuất hiện, âm tính (-) khi không có vòng đỏ xuất hiện.
Thử nghiệm methyl red: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường glucose photphate ủ trong khoảng 24 giờ ở 37oC . Thêm vào vài giọt thuốc thử methyl red được pha theo tỉ lệ 0,1g trong 300ml cồn và cho nước vào để đạt thể tích 500ml. Phản ứng dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ. Phản ứng âm tính khi môi trường giữ nguyên màu vàng.
Hình 3.10: Nghiệm pháp IMViC [12] A: Indol (+) , B: Methyl red(+)
C: Voges Prokauer (-), D: khả năng sinh citrate (-)
Thử nghiệm Voges-Proskauer: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường glucose
photphate ủ trong khoảng 2-5 ngày. thêm vào vài giọt dung dịch KOH 40 % sau đó
thêm dung dịch 1-αnapthol 5% tỷ lệ 1:3. Quan sát phản ứng trong khoảng 5 phút. Phản
ứng Voges-Proskauer dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ hay hồng sáng,
phản ứng âm tính khi không có sự chuyển màu.
Thử nghiệm citrate : Cấy vi sinh vật vào môi trường thạch nghiên Simmon
Citrate có màu xanh lục, ủ khoảng 24 giờ ở 37oC. Phản ứng dương (+) tính khi môi trường đổ sang màu xanh dương, âm tính (-) khi môi trường không đổi màu.
Kết quả thử nghiệm phát hiện E.coli (bảng 3.1)
Bảng 3.1: Ghi nhận kết quả thử nghiệm sinh hoá
TT Thử nghiệm sinh hoá Kết quả
1 Indol +
2 Methyl red +
3 Voges Prokauer -
4 Khả năng sử dung citrate -
Ghi kết quả
Phát hiện E.coli khi thử nghiệm IMViC có kết quả (+ + - - ) ( hình 3.10)
Không phát hiện E.coli
khi thử nghiệm IMViC không có kết quả (+ + - - )
Phát hiện hay không phát hiện E.coli trong 25g mẫu
