CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM CHẾ BIẾN SẴN.
3.4.1 Phương pháp đổ đĩa
3.4.1.1 Ý nghĩa
Là chỉ tiêu đánh giá chất lượng thực phẩm (khả năng hư hỏng, thời gian bảo quản), đánh giá mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản.
3.4.1.2 Nguyên tắc
Để xác định số lượng vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng thực phẩm bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc phải qua quá trình đồng nhất, pha loãng thành các nồng độ xác định. Chuyển một thể tích xác định các độ pha loãng đã đồng nhất vào trong môi trường nuôi cấy. Các khuẩn lạc hình thành trong môi trường sau khi ủ được xem như chúng hình thành từ một tế bào riêng lẻ. Theo yêu cầu của tiêu chuẩn Việt Nam chỉ tiêu này được ủ 30oC trong 72 giờ ± 6 giờ hoặc 37oC trong 48 giờ ± 6 giờ.
3.4.1.3 Môi trường sử dụng
- Môi trường pha loãng mẫu: Saline Pepton Water ( SPW) hoặc Buffer Pepton Water (BPW).
- Môi trường nuôi cấy : Plate Count Agar (PCA)
3.4.1.4 Quy trình phân tích
Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất được độ pha loãng 10-1
Pha loãng mẫu trong nước muối sinh lý để được các độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4.
Lật ngược đĩa ủ ở 30oC trong 72 giờ hoặc 37oC trong 48 giờ
Từ mỗi độ pha loãng hút 1ml mẫu cho vào đĩa petri đã vô trùng, đổ khoảng 15ml môi trường PCA đã hấp khử trùng và làm nguội đến 45oC. Mỗi độ pha loãng làm
2 đĩa.
3.4.1.5 Thuyết minh quy trình
Chuẩn bị mẫu.
Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher). Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá 150 giây. Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Khi đó, ta sẽ được dung dịch pha loãng 10-1.
Dịch được pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipetman hút 1ml từ độ pha loãng 10-1 cho vào 9ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng, đồng nhất ta đươc 10-2. Hút 1ml từ độ pha loãng 10-2 cho tiếp vào 9ml nước muối sinh lý, đồng nhất ta được 10-3. Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha loãng cần thiết.
Chọn độ pha loãng từ 10-2 đến 10-4, dùng pipetman hút 1ml mỗi độ pha loãng cho vào 2 đĩa petri đã khử trùng. Tiếp tục đỗ khoảng 15ml môi trường PCA đã hấp khử trùng để nguội khoảng 45oC, lắc đều bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ từ 3-5 lần. Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang và chờ môi trường đặc lại, lật ngược đĩa ủ 30oC sau 72 giờ hoặc37oC trong 48 giờ (hình 3.2). Chọn tất cả đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 khuẩn lạc để đếm
Hình 3.2 Phương pháp thực hiện đổ đĩa phân tích tổng vi sinh hiếu khí [10]
- Nếu ở nồng độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa lớn hơn 250. Ví dụ: ở nồng độ 10-5 số đếm được lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2,5x107 CFU/ml
- Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa nhỏ hơn 25. Ví dụ: ở nồng độ 10-1 số đếm được nhỏ hơn 25, kết quả được ghi: <2,5x102 CFU/ml
- Khuẩn lạc mọc loang tính là 1 khuẩn lạc
Công thức tính kết quả
Đếm tất cả các số khuẩn lạc xuất hiện trên các khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25- 250 để tính kết quả. Mật độ tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g hay 1ml mẫu được tính theo cong thức sau
Trong đó: A: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc ) trong 1g mẫu N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường fi: Độ pha loãng tương ứng
Ví dụ: Trong 1 trường hợp phân tích 1g mẫu cụ thể nhận được kết quả như sau:
Kết quả: Nồng độ pha loãng 10-3 10-4 10-5
Đĩa 1 235 26 16 Đĩa 2 246 21 10 ) / ( 10 . 4 , 2 0001 , 0 . 1 . 1 001 , 0 . 1 . 2 26 246 235 5 g CFU A = + + + = 3.5 Định lượng tổng số Coliforms 3.5.1 Phương pháp đổ đĩa 3.5.1.1 Ý nghĩa
Là chỉ tiêu đánh giá chất lượng thực phẩm (khả năng hư hỏng, thời gian bảo quản), đánh giá mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản.
3.5.1.2 Nguyên tắc (cfu/g) ... 1 1 1 V f ni Vi fi n N A × × + + × × =
Mẫu đã được đồng nhất hoá được cấy 1 lượng nhất định trên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose và sinh acid sau khi ủ ở 37 ±10C trong 24 – 48 giờ. Ngoài lactose, môi trường chọn lọc cho Coliforms còn chứa muối mật ức chế vi khuẩn gram dương và chất chỉ thị pH như Neutral red, crystal. Trên môi trường này khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến màu đỏ đậm, đường kính > 0,5mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa của muối mật. Việc khẳng định được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trường canh chọn lọc như BGBL.
Mật độ Coliforms được tính dựa trên số lượng khuẩn lạc điển hình đếm được, tỷ lệ khẳng định và độ pha loãng trước khi cấy vào đĩa.
Để phát hiện được bộ phận tế bào Coliforms bị tổn thương hay bị giảm sức sống do quá trình chế biến hay bảo quản thực phẩm, bộ phận này có thể không tăng trưởng được trong môi trường chọn lọc, trước khi mẫu được cấy vào một môi trường không chọn lọc như TSA, trước khi bổ sung môi trường chọn lọc.
3.5.1.4 Thuyết minh quy trình
Chuẩn bị mẫu.
Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu được độ pha loãng 10-1.
Đếm các khuẩn lạc có màu đỏ đếm đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, có đường kính > 5mm
Xác định tỷ lệ R. Tính kết quả. ủ ở nhiệt độ 37oC, trong 24 giờ
Chọn 3-5 khuẩn lạc của 2 đĩa cấy vào 5 ống BGBL Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất 30 giây
Lấy 1ml mẫu trên cho vào 2 đĩa Petri trống đã vô trùng
Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ 37oC, trong 24 giờ
Đỗ khoảng 15ml môi trường VRB đã đun tan và làm nguội 45oC Đỗ khoảng 5ml TSA tan chảy và làm nguội đến 45oC, lắc đều
Hình 3.4: Khuẩn lạc Coliforms [8]
Cấy mẫu.
Dùng pipetman hút 1ml mẫu cho vào đĩa petri trống. Đỗ khoảng 5ml môi trường TSA đã hấp khử trùng để nguôị 45oC, lắc đều để ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ. Gai đoạn này nhầm khôi phục các tế bào bị tổn thương hay bị suy yếu. Làm trên 2 đĩa.
Đỗ thêm 15ml môi trường VRB (môi trường VRB dùng nước cất đã hấp khử trùng, đun sôi sau đó cho môi trường vào, không hấp khử trùng môi trường này) để
nguôị 45oC, lắc đều để đặc môi trường. Giai đoạn này nhằm chọn lọc vi khuẩn
Coliforms.
Lật ngược đĩa ủ ở 37oC trong 24 giờ ( hình 3.5)
Đếm tất cả các khuẩn lạc trên cả hai đĩa. Khuẩn lạc đặc trưng của Coliforms có màu đỏ đến đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, đường kính > 0.5mm ( hình 3.4)
Hình 3.5 Phương pháp đổ đĩa phân tích tổng số Coliforms [11]
Thử nghiệm khẳng định.
Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy vào 5 ống môi trường BGBL, có ống Durham. Ủ 24 giờ, đếm các ống có sinh hơi tính tỉ lệ R ( hình 3.6)
Ghi kết quả
Ghi kết quả: Số khuẩn lạc trên cả 2 đĩa. Số ống sinh hơi.
Công thức tính Tổng số Coliforms (cfu/g).
Trong đó C: Tổng cố khuẩn lạc đặc trưng trên tổng số đĩa chọn đếm. N: lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ.
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa. f: độ pha loãng tương ứng.
R = (Số khuẩn lạc sinh hơi trong BGBL) / (Số khuẩn lạc đã cấy).
Ghi nhận kết quả: Tổng số Coliforms phát hiện trong 25g mẫu