- Mẫu tế bào được nuôi cấy cảm ứng lượng lớn 200 ml bằng IPTG với nồng
3.7.Tinh sạch protein tái tổ hợp FljB
20o 25 30 37 đc20o 25 30 37 đc
3.7.Tinh sạch protein tái tổ hợp FljB
kDa 66,2 45 35 25 18,8 14,4 1 2 3 4 5 6 7 FljB
Hình 3.16. Phân tích sản phẩm protein của tế bào E. coli BL21 mang gen fljB trên gel polyacrylamit 12,6%
Đườngchạy số 1: Thang proteinchuẩn
Đường chạy số2-7: Protein thu được sau khi cảm ứng 0, 1, 2, 3, 4, 5 giờ của chủng E. coli BL21 mang plasmit pET32fljB
Sau khi biểu hiện thành công protein tái tổ hợp FljB trong vi khuẩn E.
coli BL21, chủng vi khuẩn này được nuôi cấy cảm ứng lượng lớn để tiến hành
tinh sạch qua cột sắc kí ái lực His-tag. Protein tổng số được cho qua cột ái lực His-tag để tiến hành tinh sạch protein fljB. Protein được tổng hợp sẽ là một protein tái tổ hợp mang thêm 6 axit amin Histidin ở vùng nối Thioredoxin và fljB. Dưới điều kiện pH thích hợp (pH =7 hoặc hơi kiềm) và nồng độ của đệm gắn Imidazol phù hợp 50 mM, ion Ni gắn trên hạt Sepharoza tạo liên kết tĩnh điện với đuôi Histidin. Khi đó, protein tái tổ hợp sẽ được giữ lại trên cột. Sau khi đã rửa sạch những protein không mong muốn với nông độ của đệm rửa chứa100 mM Imidazol, protein tái tổ hợp được thu lại nhờ đệm thu mẫu có nồng độ Imidazol phù hợp ở 500 mM, làm cho liên kết tĩnh điện giữa Ion Ni và đuôi His-tag được phá vỡ. Vì vậy, protein tái tổ hợp theo dịch thu ra ngoài cột.
Sản phẩm protein tái tổ hợp được thu theo từng phân đoạn 2 ml một phân đoạn và được kiểm tra trên điện di polyacrylamit 12,6% hình 3.17.
66,2kD FljB 1 2 3 4 5 6 7 8 kDa 66,2 45 35 25 18,8 14,4
Hình3.17. Phân tích protein tinh sạch trên gel polyacrylamit 12%
Đường chạy 1: Protein thô chưa tinh sạch Đường chạy 2: Protein không bám lên cột
Đường chạy 3: Protein được rửabằngđệm rửa Đường chạy 4: Thang protein chuẩn (Gibco)
Đường chạy 5-8: Protein được tinh sạch theo các phân đoạn 1, 2, 3, 4.
Trong quá trình tinh sạch, protein được thu theo các phân đoạn khác nhau được đánh số từ 5-8. Kết quả kiểm tra trên hình 3.17 cho thấy, từ đường chạy 5-6 xuất hiện những băng protein, đậm nét, nhất là với đường chạy 6 với kích thước phân tử khoảng 66 kDa. Kích thước của các băng protein đó phù hợp kích thước băng protein FljB biểu hiện trên hình 3.15 và bằng với protein thô 66 kDa, mặt khác protein ở đường chạy 3, 4 tiêu hao ra ngoài rất ít, biểu hiện trên hình rất mờ. Điều này chứng tỏ proein FljB biểu hiện trong E. coli đã tinh
sạch thành công, với độ tinh sạch cao. Trong các phân đoạn protein thu được, phân đoạn 5 cho lượng protein tinh sạch thấp nhât, còn phân đoạn 6 cho lượng protein tinh sạch cao nhất (thể hiện là băng protein đậm nhất).
Như vậy gen fljB mã hoá cho kháng nguyên roi H: 1,2 được kết luận là bước đầu của sự thành công. Vì điều kiện về thời gian nên chúng tôi mới nghiên cứu được đến đây. Tuy nhiên qua nghiên cứu các tài liệu thì chúng tôi thấy rằng kháng nguyên tái tổ hợp FljB, nguồn gốc từ S.
typhimurium, có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch đặc hiệu tốt. Khả năng này
tương đương với khả năng đáp ứng miễn dịch của tự nhiên. Vì vậy chúng tôi hi vọng sẽ tạo ra được loại vacxin mới an toàn và hiệu quả trong việc phòng ngừa vi khuẩn gây bệnh S. typhimurium.
Kết luận
Trong quá trình trình thực hiện đề tài: “phân lập và biểu hiện gen fljB mã hoá cho kháng nguyên roi (H): 1,2 của S. typhimurium trong tế bào
escherichia coli BL21” chúng tôi đã đạt được kết quả sau:
1. Tách chiết thành công hệ gen của vi kuẩn Salmonella
2. Tách dòng thành công gen fljB vào vector pCR2.1, gen có trình tự tương đồng 100% với gen fljB trên ngân hàng gen mã số AF045151
3. Thiết kế thành công vector biểu hiện pET32fljB mang gen ngoại lai
fljB
4. Biểu hiện thành công gen fljB mã hoá kháng nguyên roi H: 1,2 của S.
typhimurium trong tế bào E. coli BL21, gen biểu hiện tốt nhất ở 30oC trong môi trường có chất cảm ứng IPTG 0,1 mM và protein tan tốt ở trong nướckhoảng 90%
5. Tinh chế thành công protein tái tổ hợp qua cột sắc kí ái lực His-tag.
định hướng nghiên cứu
Kiểm tra khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp ở gà
TàI liệu tham khảo Tiếng Việt (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});