- Mẫu tế bào được nuôi cấy cảm ứng lượng lớn 200 ml bằng IPTG với nồng
3.4.4. Cắt kiểm tra plasmit tái tổ hợp pET32fljB
Cũng tương tự với việc chọn lọc plasmit trong quá trình tách dòng, các plasmid mang gen ngoại lai đã thu được ở trên, được kiểm tra xem gen ngoại lai chèn vào đúng là gen mong muốn hay chưa. Chúng tôi tiến hành cắt kiểm tra bằng hai enzim Hind III+ Xba I. Vì trong gen fljB có điểm cắt của enzim hạn chế Hind III ở vị trí 566 còn enzim Xba I nằm trên vector cách điểm cắt của enzim Nco I dùng để đưa gen fljB là ≈ 0,5 Kb, khi cắt vector bằng hai 2 enzim này sẽ cho ra đoạn gen có kích thước 1 Kb. Hơn nữa khi sử dụng enzim ở trong gen để cắt thì kết quả sẽ chính xác hơn. Còn pET32a(+) cho ra một băng khoảng 5,9 Kb.
Hình 3.9. Phân tích ADN plasmit tái tổ hợp trên gel agaroza 0,8% Đường chạy 2-3: pET32fljB
Đường chạy 1: pET32(+)
pETfljB pET32a(+)
Hình 3.10. cho thấy, các băng ADN thể hiện trên điện di đồ đúng như tính toán lý thuyết. Như vậy, chúng tôi có thể kết luận vector pET32fljB đã được thiết kế thành công.
Để chắc chắn hơn, chúng tôi đã kiểm tra gen bằng 2 enzim hạn chế Nco I + Xho I. Theo tính toán lý thuyết cũng cho ra 2 đoạn băng ADN có kích thước (1,5 Kb + 5,9 Kb), còn pET32a(+) cũng chỉ cho ra một băng có kích thước là 5,9 Kb. Kết quả được thể hiện trên hình 3.11.
Hình 3.10. Phân tích sản phẩm cắt plasmit tái tổ hợp pET32fljB bằng
Xba I và Hind III trên gel agaroza 0,8% Đường chạy số1-4: Dòng pET32fljB Đường chạy số 5: Dòng pET32a(+)
Đường chạy 6: Thang ADN chuẩn 1 Kb(Gibco)
a 0,5 1 2 3 4 5 6 1,5 1,0 Kb 6,0 a
Kết quả trên điện di đồ chúng ta thấy kích thước băng ADN với chiều dài 1,5 Kb đúng như tính toán lý thuyết.
Như vậy một lần nữa khẳng định rằng gel fljB đã được ghép nối thành
công vào vector biểu hiện pET32a(+). Vector này được biến nạp vào chủng vi khuẩn E. coli BL21 để nghiên cứu biểu hiện gen.