- Mẫu tế bào được nuôi cấy cảm ứng lượng lớn 200 ml bằng IPTG với nồng
3.1.Tách chiết ADN hệ gen của S typhimurium
Để có được gen fljB trước hết phải tách chiết thành công ADN hệ gen của vi khuẩn S. typhimurium. Do vi khuẩn S. typhimurium cùng họ với tế bào E.
coli nên quy trình tách chiết được tiến hành giống với việc tách chiết ADN hệ
gen của vi khuẩn E. coli. Sau đó ADN hệ gen được sử dụng làm khuôn mẫu cho việc tổng hợp đoạn gen fljB bằng kỹ thuật PCR. Kĩ thuật PCR muốn đạt kết quả tôt đòi hỏi ADN hệ gen phải có độ tinh sạch và tính đồng nhất cao với lượng ADN phù hợp. Nếu ADN hệ gen không đảm bảo độ tinh sạch thì rất nhiều tạp chất tồn tại trong đó sẽ làm giảm hiệu quả của kĩ thuật PCR. Để tách chiết ADN hệ gen của vi khuẩn S. typhimurium, chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo phương pháp Murray và Thompson [8]. Đầu tiên, để thu sinh khối tế bào, chủng vi khuẩn S. typhimurium được nuôi cấy qua đêm trên môi trường LB lỏng ở 37oC. Điểm khác biệt của phương pháp này là không sử dụng lysozim để phá tế bào mà sử dụng nồng độ SDS để phá vỡ tế bào trong dung dịch TE. SDS tạo ra sức căng bề mặt rất mạnh, đồng thời tạo môi trường nhược trương làm tế bào dễ bị vỡ tung. Ngoài ra, SDS cùng với EDTA có tác dụng bất hoạt enzim phân giải ADN có sẵn trong tế bào vi khuẩn. Protein nội và ngoại bào được thuỷ phân bằng proteaza K. Những phân tử protein có khối lượng lớn còn lại sau khi xử lí enzim được loại bỏ bằng cách li tâm và các protein nhỏ bị loại bỏ bằng cách hoà tan trong dung dịch phenol/chloroform/Isoamylalcolhol và nằm ở pha dưới.
Như vậy việc xử lí dịch chứa trên đã loại bỏ hoàn toàn protein lẫn tạp chất. Dịch chứa ADN hệ gen nằm ở pha trên được thu lại và tủa trong cồn tuyệt đối. Sản phẩm sau khi tách chiết được điện di kiểm tra trên gen agaroza 0,8%. Kết quả được trình bày ở hình 3.2.
Kết quả kiểm tra trên điện di đồ cho thấy, ADN là một băng sáng rõ nét, có kích thước lớn, không lẫn ARN và từ đó cho phép chúng tôi kết luận sản phẩm tách chiết đó đủ điều kiện để làm khuôn nhân gen fljB bằng
kỹ thuật PCR.