Thể hiện qua Bảng 4.6 và Biểu đồ 4.6.
Triệu chứng a b c d e f g h i k Dƣơng tính (mẫu) 5 12 15 10 15 5 25 25 2 6 Tổng số (mẫu) 191 Tỷ lệ nhiễm bệnh (%) 2,61 6,28 7,85 5,24 7,85 2,61 13,09 13,09 1,05 3,14
Biểu đồ 4.6 Biểu diễn tỷ lệ bệnh virus trên các triệu chứng quan sát được 7.85 5.24 1.05 3.14 2.61 6.28 7.85 2.61 13.09 13.09 0 2 4 6 8 10 12 14 a b c d e f g h i k Triệu chứng tỷ lệ p hầ n tr ăm
Bảng 4.6 và biểu đồ 4.6 cho thấy những triệu chứng c, e, g, h là thƣờng thấy nhất ở cà chua bị nhiễm virus TMV hay CMV.
T
ỷ
l
ệ
Hình 4.3 Triệu chứng lá cà chua Hình 4.4 Triệu chứng lá cà chua
có nhiễm TMV và CMV có nhiễm TMV và CMV
Hình 4.5 Triệu chứng lá cà chua Hình 4.6.1 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV có nhiễm CMV
Hình 4.6.2 Triệu chứng lá cà chua Hình 4.7 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV có nhiễm CMV
Hình 4.8 Triệu chứng lá cà chua Hình 4.9 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV có nhiễm CMV
Hình 4.10 Triệu chứng lá cà chua Hình 4.11 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV có nhiễm CMV
Hình 4.12 Triệu chứng lá cà chua
4.2 Kết quả RT - PCR
Từ kết quả chẩn đoán bằng ELISA, chúng tôi chọn những mẫu có chỉ số dƣơng tính cao nhất và tiến hành phản ứng RT - PCR trên một số cặp primer nhằm bƣớc đầu tìm quy trình RT - PCR để chẩn đoán TMV.
Kết quả RT - PCR sử dụng cặp primer 1
- Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 1:
Ở lần RT - PCR này, chúng tôi thực hiện theo quy trình trong bộ kit của hãng Sigma nhƣng với các hóa chất của công ty BioRad. Kết quả là không có sản phẩm khuếch đại nào đƣợc tạo ra.
Nhƣ vậy là phản ứng PCR đã không xảy ra. Điều này có thể là do nhiệt độ bắt cặp (annealing) quá cao (68oC) so với nhiệt độ nóng chảy (melting) của cặp primer (Tm 57oC). Cùng một trình tự Primer nhƣng protocol gốc lại cho nhiệt độ Ta rất cao (68oC) có thể là protocol trong bộ kit với các hóa chất kèm theo và quy trình đã đƣợc chuẩn hóa ở mọi khâu và dòng virus TMV nhất định nên không thể áp dụng quy trình này đối với những thành phần khác bộ kit (Taq polymerase, buffer cho Taq polymerase, buffer cho PCR, enzyme reverse transcriptase và dòng TMV có thể khác). Cho nên cần hạ nhiệt độ Ta
xuống dƣới nhiệt độ Tm của primer.
- Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 2 (đã hạ nhiệt độ annealing xuống 54oC và tách quy trình ra 3 khoảng hạ nhiệt độ Ta từ 54oC đến 52oC và 50oC nhằm làm cho sự khuếch đại dễ dàng) thể hiện trên Hình 4.13.
+ Mẫu 1: là mẫu thu đƣợc ở Đức Trọng. Có triệu chứng điển hình của TMV nhƣ: Tất cả lá già bị xoăn, lá non méo mó, nhăn nhúm, phồng rộp, có vùng khảm xanh - vàng trên lá, lá nhỏ. Cây lùn, ít quả, quả rất nhỏ và ELISA cho kết quả dƣơng tính rất cao. Nhƣng kết quả RT - PCR lại không cho band nào.
+ Mẫu 2 là mẫu thu đƣợc ở Đức Trọng. Có triệu chứng điển hình của TMV nhƣ: Tất cả lá cây bị xoăn, méo mó, nhăn nhúm, phồng rộp, nhỏ, kéo dài nhƣng lá có những vùng xanh đậm, xanh nhạt xen kẽ. Cây lùn, ít quả, quả rất nhỏ và ELISA cho kết quả dƣơng tính rất cao. Và kết quả RT - PCR cho 2 band, một band rất đậm (khoảng 800 bp) và một band rất mờ (khoảng 1200 bp).
Hình 4.13 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên mẫu 1 và 2 với primer (1) thiết kế cho việc khuếch đại một đoạn có kích thƣớc 444 bp trên genome TMV.
Nhƣ vậy, sản phẩm thu đƣợc (ở mẫu 2) có kích thƣớc lớn hơn sản phẩm mong đợi rất nhiều. Nên có thể là do thời gian kéo dài lâu (45 giây) nên sản phẩm phụ dài hơn xuất hiện và những sản phẩm này ức chế sản phẩm mong đợi. Nhiệt độ Ta khá thấp nhƣng không thể tăng lên vì nếu tăng Ta lên thì những band lớn hơn sẽ xuất hiện thay vì band mong đợi. Cho nên vẫn giữ nhiệt độ Ta mà giảm thời gian kéo dài chuỗi. Mẫu 1 không có sản phẩm tạo ra có thể là do không ly trích đƣợc RNA (dù cùng một quy trình tách chiết nhƣng lƣợng virus trong mẫu khác nhau có thể dẫn đến kết quả khác nhau) hay do lƣợng RNA thu đƣợc từ quá trình ly trích quá ít.
- Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 3 (đã giảm thời gian kéo dài xuống 30 giây) thể hiện trên Hình 4.14.
+ Mẫu 1: có 3 band khoảng 600, 800 và 900 bp.
Hình 4.14 Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 3 trên mẫu 1 và 2 với primer (1) thiết
kế cho việc khuếch đại một đoạn có kích thƣớc 444 bp trên genome TMV và quy
trình thay đổi so với lần 2.
Nhƣ vậy, hƣớng đi đã đúng nhƣng sản phẩm mong muốn vẫn chƣa đƣợc tạo ra. Có thể là do nhiệt độ kéo dài hơi cao (68oC) hay do lƣợng mẫu hơi nhiều. Nên cần hạ nhiệt độ kéo dài và thử giảm nồng độ mẫu RNA trong phản ứng.
- Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 4 (hạ nhiệt độ kéo dài xuống còn 65oC) thể hiện trên Hình 4.15: Không có sản phẩm nào xuất hiện trên cả hai nghiệm thức.
Hình 4.15 Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 4 trên mẫu 1 và 2 với quy trình primer (1) thiết kế cho việc khuếch đại một đoạn có kích thƣớc 444 bp trên genome TMV
với nhiệt độ kéo dài 650
C.
Nhƣ vậy, giả thuyết về nhiệt độ kéo dài cao là không hợp lý và giả thuyết về lƣợng RNA nhiều làm ức chế sản phẩm mong muốn có thể là đúng hoặc sai. Bởi vì nhiệt độ kéo dài không đúng nên không cho sản phẩm thì không khẳng định đƣợc liều lƣợng RNA mẫu ảnh hƣởng tới PCR nhƣ thế nào. Nên cần sử dụng lại quy trình thứ 3 để kiểm tra lại lƣợng RNA mẫu.
Nhƣng kết quả PCR lại không cho một sản phẩm nào trên cả mẫu vừa ly trích lẫn mẫu cũ đã sử dụng trong phản ứng RT - PCR lần 3 (Hình 4.17).
Hình 4.17 Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 5 trên mẫu 1 và 2 với primer (1) thiết kế cho việc khuếch đại một đoạn có kích thƣớc 444 bp trên genome TMV và quy
trình của lần RT - PCR thứ 3.
Nhƣ vậy, ở nghiệm thức sử dụng cùng một quy trình với cùng lƣợng mẫu RNA trên cùng một mẫu RNA nhƣ lần 3 mà không cho ra sản phẩm nhƣ lần 3 có thể là do:
+ Lƣợng RNA đã bị giảm xuống theo thời gian do bị phân cắt, đứt gãy trƣớc khi biến thành cDNA để đƣa vào quy trình PCR.
+ Máy PCR khác nhau có thể ảnh hƣởng đến phản ứng PCR.
+ Quy trình phản ứng PCR chƣa ổn định.
Đối với mẫu vừa ly trích và đƣợc chứng minh là có RNA nhƣng không có phản ứng có thể là do:
+ Chỉ có RNA của thực vật mà không có RNA của virus (có thể do RNA của virus vốn rất ít lại bị đứt gãy trong quá trình tách chiết) hay RNA của virus thu đƣợc từ quá tách chiết không đủ cho sản phẩm khuếch đại có thể thấy đƣợc trên gel agarose.
+ Máy PCR khác nhau có thể ảnh hƣởng đến phản ứng PCR.
+ Hóa chất sau nhiều lần sử dụng có một thành phần nào đó bị mất hoạt tính. + Quy trình phản ứng PCR chƣa ổn định.
- Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 6 (sử dụng hóa chất mới, RNA ly trích mới, cùng quy trình và máy PCR nhƣ RT - PCR lần 3: không có sản phẩm PCR tạo ra.
Nhƣ vậy, trong trƣờng hợp này không phải máy PCR hay hóa chất ảnh hƣởng đến phản ứng RT - PCR. Có thể là do quy trình chƣa ổn định. Hay do lƣợng RNA ly trích lần này có quá ít RNA đích do sử dụng primer hexamer trong phản ứng reverse (cơ hội tạo ra cDNA từ RNA của virus sẽ khác nhau giữa các lần tách chiết), cho nên sản phẩm của phản ứng PCR có đƣợc tạo ra nhƣng quá ít và không thể quan sát qua điện di trên gel.
Sử dụng phần mềm PCGEN và Blast trình tự primer trên internet cho thấy:
+ Vùng gen mã hóa cho polymerase của TMV rất khác nhau giữa các dòng TMV trên thế giới, có những dòng khác biệt chỉ có 82% tƣơng đồng với dòng khác.
+ Trình tự primer lại nằm trong vùng rất biến đổi của TMV. Hơn nữa, đầu 3’ của primer lại nằm ở base hay biến đổi nhất.
Nhƣ vậy, nếu sử dụng cặp primer này thì cơ hội có sản phẩm mong muốn là rất ít, bởi vì:
+ Dòng TMV của Việt Nam chƣa đƣợc xác định nên không biết thuộc dòng nào. Nhƣ vậy có nhiều khả năng primer bắt cặp không đặc hiệu với cDNA từ TMV.
+ Đầu 3’ của primer rất hay biến đổi nên có nhiều khả năng đầu 3’ của primer không bắt cặp đƣợc với sợi khuôn. Trong trƣờng hợp đó thì taq polymerase không thể nào kéo dài chuỗi từ đầu 3’ đƣợc.
Cho nên nếu sử dụng primer này thì có thể không có sản phẩm hoặc là sản phẩm tạo ra là không đặc hiệu.
Nhƣ thế cần thiết phải thiết kế primer trên vùng khác bảo tồn hơn. Kiểm tra lại trình tự genome TMV cho thấy: vùng gen mã hóa cho protein vỏ của virus này có tính bảo tồn cao hơn giữa các dòng. Đặc biệt, đoạn mã hóa cho protein vỏ lại có kích thƣớc rất ngắn, chỉ có 479 bp (từ base 5712 đến 6191). Hơn nữa nếu thiết kế primer chứa cả trình tự mã hóa cho protein vỏ thì có thể clone nó vào những plasmid phục vụ cho nghiên cứu sau này mà quan trọng là nghiên cứu tạo gen kháng TMV.
Dựa vào kết quả đã thực hiện và việc tìm hiểu kỹ hơn về genome TMV cùng với việc áp dụng phần mềm PCGEN, chúng tôi quyết định:
+ Không tiếp tục sử dụng cặp primer (1) để thực hiện RT - PCR.
+ Không chạy RT - PCR với PCR thƣờng mà thực hiện Nested PCR (PCR 2 lần với 2 cặp primer) vì có thể RNA đích là rất ít.
+ Sử dụng trình tự primer bao trùm cả vùng gen mã hóa protein vỏ của TMV.
Kết quả RT-PCR sử dụng 2 cặp primer 2 và 3
Từ những vấn đề cùng với những suy luận trên mà chúng tôi quyết định thiết kế 2 cặp primer khác nhằm tìm kiếm sự khuếch đại một đoạn RNA của TMV ở vùng bảo toàn hơn. Do trình tự của TMV có biến động rất lớn nên chúng tôi sử dụng trình tự dòng TMV của Trung Quốc (khá gần Việt Nam) để thiết kế primer. Các kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
- Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 1, 2 thể hiện trên Hình 4.18
+ Ở lần 1, chạy PCR với primer ngoài trên 4 mẫu 1, 2, 3, 4. Theo lý thuyết nếu có band xuất hiện thì kích thƣớc là 921 bp. Nhƣng kết quả không đạt đƣợc nhƣ lý thuyết: Ở cả 4 mẫu đều có cùng số lƣợng band và kích thƣớc nhƣ nhau là khoảng 450, 250 và 100 bp.
Nhƣ vậy, có thể có các khả năng sau:
Primer ngoài không đặc hiệu do virus dòng ở Việt Nam đã thay đổi so với dòng tham khảo để thiết kế primer.
Primer này đã bắt cặp vào một trình tự virus khác tƣơng đồng với trình tự genome virus TMV và có thể bắt cặp ở nhiều vị trí trên genome nên tạo band không đặc hiệu.
Primer này cũng khuếch đại đƣợc một lƣợng cDNA nhƣng số lƣợng quá thấp không thể quan sát đƣợc trên gel agarose đồng thời khuếch đại đƣợc những trình tự khác với số lƣợng lớn hơn.
Từ 3 khả năng trên chúng tôi thử chạy nested – PCR sử dụng sản phẩm PCR lần 1 làm khuôn mẫu, hy vọng sẽ khuếch đại đƣợc sản phẩm mong muốn đang tồn tại với số lƣợng ít. Hai khả năng đầu có thể có nhƣng tạm thời chƣa xác định đƣợc.
+ Kết quả PCR lần 2 (sử dụng primer trong và khuôn mẫu là sản phẩm của phản ứng PCR lần 1.
Mẫu 1 có một band khoảng 250 bp và mờ nhòe kéo dài (smear) ở phía trên. Mẫu 2 có một band khoảng 250 bp, một band 100 bp, mờ nhòe kéo dài (smear) ở phía trên.
Mẫu 3 có một band khoảng 250 bp và mờ nhòe kéo dài (smear) ở phía trên Mẫu 4 chỉ có mờ nhòe kéo dài (smear).
Nhƣ vậy đây không phải là sản phẩm đặc hiệu mà ta cần vì :
Nested - PCR cho độ đặc hiệu gấp đôi PCR thƣờng nên nếu có sản phẩm mong muốn thì sản phẩm đó sẽ đậm và không bị mờ nhòe kéo dài (smear) nhƣ vậy.
Từ đó có thể suy ra PCR lần 1 không khuếch đại đƣợc đoạn DNA mong muốn. Phải chăng là do thiếu thành phần phản ứng nhƣ dNTP, primer và thiếu MgCl2 nên không tạo đƣợc sản phẩm mong muốn khá dài? Từ khả năng đó, chúng tôi tăng nồng độ dNTP, primer và MgCl2 lên ở các phản ứng 3, 4 và 5. Hơn nữa PCR lần 1 vẫn có sản phẩm, có nghĩa là nếu có RNA thì chạy PCR thƣờng cũng có thể thấy trên gel agarose nếu lƣợng RNA khá lớn. Do đó, chúng tôi thử chạy PCR sử dụng cặp primer trong để khuếch đại cDNA ở lần PCR thứ 5. Mặc khác, sản phẩm thu đƣợc ngắn hơn sản phẩm mong muốn rất nhiều và sản phẩm mong muốn khá dài (921 bp) nên thử dùng DMSO (dimethyl sufoxide) để hỗ trợ phản ứng PCR. Do sản phẩm tạo ra là không đặc hiệu nên chúng tôi tăng Ta lên 60oC.
- Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 3, 4, 5 thể hiện trên Hình 4.19
Hình 4.19 Kết quả PCR lần 3 sử dụng cặp primer ngoài, lần 4 sử dụng cặp primer trong và sản phẩm PCR của lần 3 làm khuôn mẫu, lần 5 sử dụng primer
trong và dung cDNA làm khuôn mẫu cho sự khuếch đại trên 1, 2, 3 và 4
Tăng nồng độ dNTP, primer và MgCl2 lên trong phản ứng 3, 4, 5, sử dụng thêm DMSO đồng thời PCR sử dụng cặp primer trong để khuếch đại cDNA trên 4 mẫu (mẫu 1 và 2 chọn từ những phản ứng RT - PCR đầu tiên, mẫu 3 và 4 chọn những mẫu có biểu hiện bệnh virus và chỉ số dƣơng tính cao) cho thấy nhƣ sau:
+ PCR lần 3 sử dụng cặp primer ngoài:
Mẫu 1: mờ nhòe kéo dài (smear) từ band khoảng 250 trở xuống dƣới.
Mẫu 2: có một band khoảng 500 bp, một band 250 bp, mờ nhòe kéo dài (smear) từ band khoảng 250 trở xuống dƣới. Có band khoảng 800 rất mờ.
Mẫu 3: mờ nhòe kéo dài (smear) từ band khoảng 250 trở xuống dƣới. Mẫu 4: mờ nhòe kéo dài (smear) từ band khoảng 250 trở xuống dƣới.
Với hy vọng PCR lần 3 cũng khuếch đại đƣợc một số lƣợng nhỏ sản phẩm mong muốn nhƣng không thấy nên chúng tôi thực hiện phản ứng PCR 4 từ sản phẩm PCR lần 6.
+ PCR lần 4 sử dụng cặp primer trong và sản phẩm PCR 3 nhƣ khuôn mẫu. Kết quả nhƣ sau:
Mẫu 1 có một band khoảng 500 bp rất nhạt và mờ nhòe kéo dài (smear) ở phía trên.
Mẫu 2 có một band khoảng 500 bp rất nhạt. Mẫu 3 và mẫu 4 không có sản phẩm nào.
Nhƣ vậy PCR lần 3 đã không tạo đƣợc khuôn mẫu mong muốn cho PCR lần 4.
+ PCR lần 5 sử dụng cặp primer trong khuếch đại cDNA. Kết quả nhƣ sau:
Mẫu 1 không có sản phẩm.
Mẫu 2 có một band khoảng 1000 bp rất đậm và một band khoảng 300 bp. Mẫu 3 có một band khoảng 1000 bp nhạt.
Mẫu 4 không có sản phẩm.
Từ quy trình 3, 4 và 5 cho thấy việc tăng nồng độ các hóa chất là không có hiệu quả. Do đó, không cần tăng hóa chất nhƣng chúng tôi vẫn giữ mức dNTP nhƣ lần 3 vì sản phẩm mong muốn khá dài. Khi PCR sử dụng primer trong thì sản phẩm thu đƣợc có kích
