Trong kỹ thuật phát hiện virus thực vật mới này, một đĩa tinh thể thạch anh đƣợc phủ với kháng thể chuyên biệt cho virus. Cho một điện thế qua đĩa sẽ làm cho đĩa hơi bị lệch vì ảnh hƣởng của áp lực điện. Sự hấp thu các phần tử virus lên bề mặt tinh thể sẽ làm thay đổi tần số dao động cộng hƣởng theo kiểu phụ thuộc vào nồng độ. Do đó, có thể định lƣợng virus. Phát triển kỹ thuật này với mục tiêu là độ nhạy của nó bằng ELISA nhƣng nhanh hơn ELISA và kinh tế. Có thể phát hiện ở nồng độ 1ng phần tử virus trong nhựa thô của cây.
2.3.5 Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào trình tự của đoạn DNA.
2.3.5.1 Phƣơng pháp RFLP - PCR (Restriction Fragenzymt Length Polymorphirm - PCR)
RFLP đƣợc sử dụng trong sự kết hợp với PCR để nhận dạng ra sự khác biệt giữa các virus dựa vào sự có mặt hay vắng mặt của những vị trí nhận biết của enzym cắt giới hạn (restriction enzyme). Sau khi thực hiện PCR, sản phẩm khuếch đại sẽ đƣợc cắt với các enzym cắt giới hạn và kích thƣớc của các mảnh sẽ đƣợc phân tích qua điện di trên gel. RFLP - PCR là phƣơng pháp có thể đƣợc sử dụng để phân biệt những dòng virus khác nhau mà không cần cloning hay đọc trình tự. Hiệu quả của nó phụ thuộc vào sự đa hình trong những vị trí nhận biết của enzym cắt giới hạn (restriction enzyme).
2.3.5.2 Phƣơng pháp PCR hay RT - PCR
RT - PCR (Reverse transcription - PCR) và PCR là 2 kỹ thuật quen thuộc dùng để phát hiện và nhận dạng virus RNA và virus DNA của cây. Quy trình này rất nhạy.
Vì đối tƣợng nghiên cứu là RNA nên chúng tôi chọn phƣơng pháp RT - PCR để nghiên cứu.
2.3.5.3 Các kỹ thuật liên quan đến PCR khác
Gồm có: Multiplex RT - PCR, Fluorescence RT - PCR using TaqmanTM
technology, competitive fluorescence PCR, immunocapture PCR, nested PCR có các ứng dụng và mục đích riêng.
2.3.5.4 Phƣơng pháp sử dụng mẫu dò đánh dấu
Sự lai của những mẫu dò (probe) DNA hay RNA cho thuận lợi là có thể phát hiện nucleic acid của virus ở cả 2 dạng sợi đơn và sợi đôi. Mẫu dò cDNA thì thích hợp hơn mẫu dò RNA khi cần phát hiện RNA virus vì thể lai RNA/RNA bền vững hơn thể lai DNA/DNA. Dịch chiết RNA từ mô bị nhiễm đƣợc chuyển lên màng và mẫu dò đƣợc lai lên đó để phát hiện.
2.3.5.5 Array
Cả microarray và macroarray đều đƣợc sử dụng nhƣ là một công cụ để xem xét những thay đổi có liên quan ở mức độ biểu hiện toàn mRNA cũng nhƣ sự đa hình của
từng nucleotide đơn và tƣơng tác giữa ký chủ - tác nhân gây bệnh. Nhƣng có những giới hạn cho việc phát hiện virus thực vật.
2.4 Phƣơng pháp DAS - ELISA và phƣơng pháp RT - PCR 2.4.1 Phƣơng pháp DAS - ELISA
DAS ELISA gồm sự dính thụ động của kháng thể vào pha rắn (đáy giếng). Những kháng thể này sau đó kết hợp với các kháng nguyên đƣợc thêm vào. Những kháng nguyên đƣợc pha loãng trong blocking buffer nhằm ngăn sự dính không chuyên biệt của chúng vào pha rắn. Ở đây, những phần của blocking buffer không nên chứa bất kỳ kháng nguyên nào mà có thể kết hợp với kháng thể bắt. Sau khi ủ và rửa, chỉ còn phức hợp kháng nguyên - kháng thể dính vào pha rắn.
Kháng thể bắt sau đó đƣợc thêm vào. Do vậy, đây là sự kết hợp trực tiếp với kháng nguyên đích và kháng thể bắt. Kháng thể thứ hai này có thể giống kháng thể một hoặc khác về nguồn động vật hay loài động vật sản xuất kháng thể. Sau khi ủ, rửa, thêm cơ chất vào và đọc trên máy đo quang phổ. Vì sử dụng một kháng thể gắn kết với enzyme nên hệ thống bị giới hạn về tính chuyên biệt và những thành phần gắn liền với kháng thể chuyên biệt. Điều này giới hạn sự linh hoạt của phƣơng pháp, ví dụ nhƣ mỗi kháng thể đƣợc sử dụng phải đƣợc đánh dấu riêng (cho những kháng nguyên khác nhau). Theo cách này, direct ELISA bị giới hạn về sự chuẩn bị kháng thể. Hệ thống cũng bị giới hạn ở chỗ kháng nguyên phải có ít nhất hai epitope vì cả hai kháng thể bắt và phát hiện đều kết hợp trực tiếp với kháng nguyên.
Kháng thể bắt trên pha rắn và kháng thể phát hiện có thể chống lại những epitope khác nhau trên phức hợp kháng nguyên. Do đó, thuận lợi khi khảo sát sự khác biệt nhỏ giữa những kháng nguyên nếu sử dụng kháng thể phát hiện và kháng thể bắt khác nhau. Việc sử dụng cùng một kháng thể bắt và phát hiện có thể dẫn đến vấn đề khi có giới hạn về vị trí gắn kết sẵn có cho sự phát hiện. Kích thƣớc và mối quan hệ không gian của các epitope trên kháng nguyên đích là rất quan trọng và có thể ảnh hƣởng mạnh đến thử nghiệm.
RT - PCR là phản ứng sinh tổng hợp DNA trên khuôn mẫu RNA, do một DNA polymerase là reverse transcriptase (RT enzyme) xúc tác.
Tổng hợp cDNA (complementary DNA) trên khuôn RNA gồm ba bƣớc : - Bƣớc 1: Chiết xuất RNA tổng số, trong đó có RNA của virus.
- Bƣớc 2: Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất nhờ reverse transcriptase. Tùy thuộc vào mục đích thí nghiệm, primer để tổng hợp sợi DNA đầu tiên có thể đƣợc lai chuyên biệt với một gen đích hay có thể kết hợp với toàn RNA. Có ba loại primer có thể dùng trong tổng hợp cDNA.
(1) Oligo (dT): kết hợp với đuôi poly A của mRNA của động vật hữu nhũ. (2) Primer chuyên biệt với trình tự đã chọn trên RNA đích.
(3) Random hexanucleotide: có thể khởi đầu sự tổng hợp cDNA ở nhiều điểm trên RNA khuôn mẫu tạo ra nhiều đoạn bản sao của toàn phân tử RNA. Chúng hữu dụng khi RNA đích là quá dài hay chứa quá nhiều cấu trúc bậc hai đến nỗi sự tổng hợp cDNA không bắt đầu hiệu quả bởi oligo (dT) hay primer chuyên biệt. Trong hầu hết trƣờng hợp, mục đích của những nhà nghiên cứu là tạo cDNA ban đầu dài và chứa nhiều thành phần của phân tử bổ sung với trình tự RNA đích. Do đó primer chuyên biệt là lựa chọn tốt nhất. Tiếp đến là oligo (dT) cũng tốt cho sự lựa chọn. Random hexamer không chuyên biệt và tạo ra những phân tử cDNA dài, ngắn khác nhau đƣợc sử dụng khi những phƣơng pháp kia không hiệu quả.
- Nhân sợi cDNA thứ nhất lên nhiều bản bằng PCR. Giai đoạn này gồm có 3 bƣớc nhƣ sau:
+ Denature (biến tính): Chuyển dây đôi thành dây đơn
+ Annealing (bắt cặp): Primer gắn vào vị trí trên dây khuôn mẫu có mã đối xứng với nó.
+ Extension (kéo dài): Kéo dài chuỗi mới nhờ enzyme polymerase.
Ba giai đoạn này lặp lại nhiều lần, để tạo nhiều sản phẩm khuếch đại. Ba giai đoạn này xảy ra trong điều kiện nhiệt độ khác nhau (ví dụ: 94oC, 55oC, 72oC) với sự trợ giúp của enzyme polymerase. Sự lặp lại theo chu kỳ thƣờng xảy ra khoảng 30 lần để làm tăng các DNA muốn có khoảng 100 triệu lần, đủ để tăng hoạt một gen thành một khối lớn hơn rất
nhiều lần so với tổng số DNA ban đầu. Độ dài của DNA đƣợc khuếch đại tùy thuộc vào số đoạn và chiều dài của primer trong phản ứng, điều kiện chất buffer, nhiệt độ bắt cặp của primer.
Thêm vào sự phát hiện virus, thuận lợi của phƣơng pháp này là sản phẩm khuếch đại có để đƣợc đọc trình tự để cung cấp dữ liệu xa hơn về kiểu của các dòng virus (strain type).
Reverse transcriptase, là một DNA polymerase phụ thuộc vào RNA làm khuôn mẫu. Hiện có hai loại Reverse transcriptase đƣợc giới thiệu trên thị trƣờng :
- AMV (Avian myeloblastosis virus) Reverse Transcriptase.
- Mo - MLV Reverse Transcriptase (Moloney murine leukemia virus).
Mo - MLV Reverse Transcriptase đƣợc dùng nhiều hơn đối với thực vật. Để tổng hợp DNA cần một đoạn primer gắn trên mẫu RNA làm chỗ khởi động.
Chú ý, khi làm việc với RNA cần cẩn thận để tạo môi trƣờng không có ribonuclease. Ribonuclease hay RNAse có thể ở mọi nơi. RNAse rất bền và khó bị bất hoạt. Cần duy trì môi trƣờng không có RNAse từ giai đoạn tinh sạch RNA cho đến suốt quá trình phân tích.
Phƣơng pháp nested - PCR
Phƣơng pháp này sử dụng hai cặp primer gọi là primer ngoài và primer trong. Phƣơng pháp gồm 2 lần PCR. Lần 1 là PCR với cặp primer ngoài. Lần 2 là PCR sử dụng khuôn mẫu là sản phẩm của lần PCR 1. Mục đích của phƣơng pháp này là nhằm tăng số khuôn mẫu đúng ban đầu nếu khuôn mẫu ban đầu quá ít, đồng thời tăng độ đặc hiệu của sản phẩm thu đƣợc lên nhiều lần.
2.5 Một số kết quả nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về bệnh do CMV, TMV và TSWV gây ra trong thời gian gần đây TSWV gây ra trong thời gian gần đây
2.5.1 Ở nƣớc ngoài
Có rất nhiều công trình nghiên cứu về ba bệnh do virus này gây ra:
- R.T. Folkertsma, R.W. Goldbach, J. Hille vào năm 2001 đã Cloning và mô tả gen SW-5 của Lycopersicon peruvianum tạo ra tính kháng TSWV.
- M. T. Momol, J. E. Funderburk, S. Olson và J. Stavisky vào năm 2002 đã sử dụng lớp phủ phản chiếu tia UV để làm giảm số lƣợng bọ trĩ và do đó giảm sự truyền TSWV đồng thời sử dụng Acibenzolar - S methyl nhằm giảm tác động của TSWV khi áp lực nhiễm tự nhiên cao.
- Ricardo B. Medeiros, Renato de O. Resende, và Antonio Carlos de Ávila vào
năm 2004 đã chứng minh đƣợc Tomato Spotted Wilt Tospovirus kích hoạt hệ thống miễn nhiễm của vectơ Frankliniella occidentalis của nó.
- Harald Jockusch, Christiane Wiegand, Birgit Mersch, và Daniela Rajes vào năm 2001 đã cho biết thể đột biến của TMV có protein vỏ nhạy cảm với nhiệt độ cảm ứng phản ứng sốc nhiệt (heat shock) ở lá thuốc lá.
- F. L. Erickson, S. P. Dinesh - Kumar, S. Holzberg, C. V. Ustach, M. Dutton, V. Handley, C. Corr và B. J. Baker đã tìm hiểu về tƣơng tác giữa gen N của thuốc lá và TMV. Gen N của thuốc lá tạo phản ứng siêu nhạy cảm khi TMV xâm nhập vào cây thuốc lá.
- Steve Whitham, Sheila Mccormick và Barbara Baker vào năm 1996 đã chuyển gen N của thuốc lá vào cà chua, tạo tính kháng TMV cho cà chua chuyển gen.
- Ki Hyun Ryu, Chung - Ho Kim và Peter Palukaitis vào năm 1998 đã chứng minh rằng protein vỏ của CMV quy định dãy kí chủ của CMV khi nhiễm vào lúa mì.
- Tomas Canto và Peter Palukaitis vào năm 1999 đã chứng minh rằng tính kháng CMV có trung gian là replicase không ức chế sự di chuyển của protein di chuyển của CMV.
- Liang - Hui Ji và Shou - Wei Ding vào năm 2001 đã phát hiện rằng suppressor của RNA chuyển gen đƣợc mã hóa bởi CMV bị cản trở bởi tính kháng có trung gian là Salicylic Acid.
2.5.2 Ở Việt Nam
Các nghiên cứu về bệnh virus còn khá mới, chỉ có một số nghiên cứu của trƣờng Đại học Nông Lâm trong những năm gần đây.
- Nguyễn Ngọc Bích, trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM vào năm 2003 đã bƣớc đầu nghiên cứu một số bệnh virus chính trên vùng thuốc lá tỉnh Tây Ninh. Dùng DAS -
ELISA để chẩn đoán một số virus trên thuốc lá nhƣ TSWV, CMV, TMV đồng thời điều tra tình hình bệnh virus trên địa bàn tỉnh Tây Ninh. Kết quả cho thấy các virus này đang phát triển khá mạnh ở vùng thuốc lá tỉnh Tây Ninh.
- Trần Thị Thu Hà, trƣờng Đại học Nông Lâm, Tp. HCM vào năm 2005 điều tra bệnh ne ngọn (TSWV) trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) trong vƣờn nhân cây con tại tỉnh Tây Ninh.
PHẦN III.
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
3.1.1 Thời gian thực hiện đề tài
Đề tài đƣợc tiến hành từ 15/02/2005 đến 30/08/2005.
3.1.2 Địa điểm thực hiện đề tài
Điều tra lấy mẫu ở hai huyện Đơn Dƣơng (gồm 16 thôn thuộc 4 xã Lạc Lâm, Lạc Xuân, Thạnh Mỹ, KaĐô và thị trấn Dran) và huyện Đức Trọng (gồm thị trấn Liên Nghĩa, thôn Trung Hiệp xã Hiệp An, thôn Quảng Hiệp xã Hiệp Thạnh, thôn Tân Hiệp, thôn Nghĩa Hiệp xã Liên Hiệp và thôn Hạ) thuộc tỉnh Lâm Đồng.
Đề tài đƣợc tiến hành ở Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, phòng Công Nghệ Sinh Học Thực Vật, trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM.
3.2 Vật liệu 3.2.1 Dụng cụ 3.2.1 Dụng cụ
- Dụng cụ thu mẫu và điều tra gồm: Bảng mẫu câu hỏi điều tra, viết, nhãn, bao nylon, máy chụp ảnh, thùng giữ lạnh, đá khô, tủ âm.
- Dụng cụ nghiền mẫu gồm: Cối, chày, nitơ lỏng.
- Dụng cụ dùng cho ELISA, RT - PCR gồm: Đĩa ELISA 96 giếng, máy rửa đĩa ELISA, máy đọc kết quả ELISA, đĩa Petri, máy ly tâm, eppendorf, đầu tip, pipet man, petcher, máy PCR, tủ mát, tủ âm, tủ laminar, bồn ủ nhiệt, tủ ủ nhiệt, tủ sấy, tủ hấp (autoclave), máy điện di, bồn nhuộm Ethidium Bromide, máy chụp hình gel, máy in nối với máy ELISA.
3.2.2 Hóa chất
- Bộ kit ELISA với đầy đủ các thành phần cần cho ELISA nhƣ buffer chiết mẫu, buffer load mẫu, buffer cho kháng thể, buffer cho conjugate (kháng thể gắn enzyme), buffer rửa, và substract buffer, kháng thể đa dòng tƣơng ứng cho từng loại virus, conjugate, dNPP (p - Nitrophenyl phosphate) do công ty BioRad cung cấp.
- Hóa chất cho RT - PCR gồm: lysis solution, low stringency wash solution, high stringency wash solution, elution solution, DNase dilution solution, DEPC (diethyl pyrocabonate), - mercaptoethanol, polyvinylpyrrolidone (PVP), ethanol, NaOH, EDTA, 5X iScript creaction mix, iScript reverve transcriptase, dNTP (deoxy nucleotide triphosphate), MgCl2, Taq polymerase, Taq 10X buffer, nƣớc không có nuclease, agarose, TAE 0,5X, ladder 100 do công ty BioRad cung cấp.
3.3 Phƣơng pháp
3.3.1 Điều tra và lấy mẫu
- Công tác điều tra tình hình bệnh virus cà chua ở Lâm Đồng tiến hành nhƣ sau: + Liên hệ Phòng Nông Nghiệp, Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật và Trung tâm Nông Nghiệp huyện để điều tra tình hình phân bố, diện tích, chủng loại giống, vùng tập trung và các yếu tố liên quan đến bệnh virus trên cà chua. Từ đó xác định địa bàn cần điều tra.
+ Điều tra tại các hộ nông dân có trồng cà chua theo mẫu điều tra đã chuẩn bị sẵn gồm các chỉ tiêu nhƣ: Chủng loại giống, kỹ thuật canh tác, tình hình sâu bệnh…
- Khâu lấy mẫu đƣợc thực hiện nhƣ sau:
+ Lấy 5 mẫu trên một ruộng dựa vào triệu chứng bệnh virus. Mẫu lá cà chua có biểu hiện triệu chứng, đƣợc cho vào bao nylon có ghi nhãn cẩn thận.
+ Mẫu đƣợc giữ lạnh trong khoảng 2 ngày và đem về phòng thí nghiệm bảo quản ở nhiệt độ -20oC cho đến khi phân tích.
3.3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.2.1 Chẩn đoán bằng DAS - ELISA:
- Bƣớc 1. Cân 0,5 gam mẫu cho vào cối và cho vào 2,5 ml dịch trích mẫu. Chuyển mẫu đã nghiền vào eppendorf 1,5ml. Ly tâm 5000 vòng, 3 phút ở 4oC. Trữ trong tủ mát và tiến hành phản ứng ELISA trong vòng 24 giờ.
- Bƣớc 2. Pha coating buffer vào kháng thể theo tỷ lệ cho sẵn. Cho vào mỗi giếng 100µl kháng thể đã pha với coating buffer. Cho vào hàng ngoài cùng 100µl nƣớc cất cho mỗi giếng. Ủ trong 2 giờ ở 37o
C.
BF: dị ch chiế t. PC: đố i chứ ng dư ơ ng. NC: đố i chứ ng âm. Không sử dụ ng. Nư ớ c cấ t. Vùng load mẫ u (số từ 1 đế n 27)
- Bƣớc 4. Cho vào mỗi giếng 100µl mẫu theo sơ đồ. Mỗi mẫu 2 giếng (lặp lại thêm 1 lần). Cho đối chứng âm, đối chứng âm, và dịch trích vào vị trí quy định trên đĩa. Ủ qua đêm ở 4oC.
- Bƣớc 5. Rửa 3 lần với nƣớc rửa bằng máy rửa ELISA.
- Bƣớc 6. Pha conjugate buffer X1 vào kháng thể đã đƣợc gắn enzyme theo tỷ lệ cho sẵn trong kit. Cho vào mỗi giếng 100µl kháng thể đã pha với coating buffer. Ủ 2 giờ ở 37o
C.
- Bƣớc 7. Rửa 3 lần với nƣớc rửa bằng máy rửa ELISA.
- Bƣớc 8. Pha Subtract buffer X1với pNPP. Cho vào mỗi giếng 100 l.
- Bƣớc 9. Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA và đọc giá trị OD sau 30 phút và sau 1