Bƣớc 1: Cân khoảng 60 mg mẫu lá ớt đã qua chẩn đốn ELISA cho kết quả dƣơng tính. Cho mẫu vào cối (đã qua xử lý với NaOH, EDTA, rửa lại bằng nƣớc cất siêu sạch, bọc giấy bạc rồi đem hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút, sấy khơ trong một ngày đêm) nghiền thành bột mịn với nitơ lỏng. Thêm nitơ lỏng thƣờng xuyên, khơng để cho mẫu bị nĩng lên.
Bƣớc 2: Lấy muỗng cho vào hết trong tube ly tâm 2ml cĩ nắp đậy (khơng cĩ RNase). Hịa tan mẫu bằng dung dịch ly giải (lysis solution) cĩ bổ sung PVP 2% (hỗn hợp này đã đƣợc trộn trƣớc: 14µl PVP 2% + 700µl dung dịch ly giải cho mỗi mẫu)
Bƣớc 3: Cho 700µl dung dịch đã đƣợc trộn ở bƣớc trên vào tube chứa mẫu, trộn thật kỹ bằng pipet khoảng 10 lần
Bƣớc 4: Ly tâm 13000 vịng trong 3 phút. Chuyển tồn bộ dịch nổi vào tube ly tâm 2ml mới.
Bƣớc 5: Thêm 700 µl ethanol 70%, hồ tan bằng pipet cho đến khi khơng cịn sự phân lớp
Bƣớc 6: Ủ ấm dung dịch hồ tan (elution solution) trong bồn ủ ở 70oC (để chuẩn bị cho bƣớc 15). Đặt RNA binding column (RNAbc) vào tube 2ml khơng nắp.
Bƣớc 7: Cho 700µl dung dịch ở bƣớc 5 vào RNAbc, ly tâm 12000 vịng trong 60 giây, loại bỏ dịch lọc. Thực hiện tƣơng tự cho đến hết phần dịch cịn lại.
Bƣớc 8: Dịch rửa low stringency từ 5X pha lỗng bằng ethanol 95 – 100% xuống cịn 1X
Bƣớc 9: Cho 700µl dung dịch low stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vịng trong 30 giây, loại bỏ dịch lọc
Bƣớc 10: Pha Dnase I với 250µl Tris 10mM pH 7.5. Hồ tan bằng pipet. Bƣớc 11: Trộn 5µl Dnase I với 75µl dung dịch Dnase dilution trong tube 1.5ml, cho vào RNAbc. Ủ ở nhiệt độ phịng trong 15 phút, ly tâm 30 giây. Loại bỏ dịch lọc.
Bƣớc 12: Cho 700µl high stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vịng trong 30 giây, loại bỏ dịch lọc.
Bƣớc 13: Thực hiện tƣơng tự nhƣ bƣớc 12 nhƣng với dung dịch low stringency.
Bƣớc 14: Ly tâm 12000 vịng trong 1 phút để loại bỏ hồn tồn dịch rửa. Bƣớc 15: Chuyển RNAbc vào tube 1.5ml cĩ nắp đậy, cho vào 80µl dung dịch hồ tan ở bƣớc 6. Để 1 phút, ly tâm 12000 vịng trong 2 phút để thu RNA tổng số. Bảo quản ở 4o
C.