Giai đoạn ly trích mẫu:
Mẫu khi lấy về trữ ở -20oC, chọn những lá vừa khơng non cũng khơng già, phiến lá lớn, cân 0,5g cho vào cối, thêm 2,5ml dịch trích mẫu. Nghiền thật nát vụn
chỉ thấy dạng dung dịch. Sau đĩ đổ vào eppendoff gần đầy và ghi ký hiệu thật cẩn thận.
Đem ly tâm tốc độ 5000vịng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ 4oC. Dùng Micropipette P1000 hút phần dịch nỗi sang một eppendoff 1.5ml mới và cũng ghi nhãn cẩn thận (loại bỏ cặn lắng). Trữ ở 4oC
Chẩn đốn ELISA
Bƣớc 1: Chuẩn bị đĩa và sơ đồ bố trí. Mỗi đĩa đƣợc bố trí 2 đối chứng âm và 2 đối chứng dƣơng.
Bƣớc 2: Pha lỗng kháng thể 1/250 trong dung dịch đệm (coating buffer). Trên mỗi đĩa sử dụng 60 giếng, mỗi giếng hút vào 100µl, chạy trên 5 đĩa, nhƣ vậy tổng cộng là 30ml, do đĩ phải pha dung dịch đệm là khoảng 35ml: pha lỗng 140µl kháng thể vào trong 35ml dung dịch đệm kháng thể, trộn thật kỹ trƣớc khi dùng. Hút 100µl dung dịch vừa pha vào mỗi giếng, dùng băng keo dán kín lại và đặt vào tủ ủ ở 37oC trong 2 giờ
Bƣớc 3: rửa với dung dịch đệm PBS – T bằng máy rửa, rửa 3 lần mỗi lần 3 phút
Bƣớc 4: mỗi đối chứng âm và dƣơng đƣợc hồ tan với 1ml nƣớc cất, hút 100µl mỗi loại đối chứng vào các giếng đối chứng, tiếp theo hút 100µl mẫu vào các giếng đã đƣợc bố trí. Đem ủ ở 4oC qua đêm
Bƣớc 5: Rửa lại với PBS – T 3 lần mỗi lần 3 phút.
Bƣớc 6: pha kháng thể cĩ gắn enzyme vào dung dịch đệm tƣơng tự nhƣ pha kháng thể ở bƣớc 2. Hút 100µl dung dịch kháng thể cĩ gắn enzyme đã đƣợc pha vào mỗi giếng , dán băng keo lại, sau đĩ đem ủ ở 37oC trong 2 giờ.
Bƣớc 7: rửa lại với PBS – T 3 lần, mỗi lần 3 phút.
Bƣớc 8: hồ tan pNPP trong dung dịch đệm Subtrate để đạt nồng độ cuối là 1mg/ml của pNPP
Cách pha: nghiền nát thành bột mịn 7 viên pNPP (mỗi viên 5mg), cho vào 35ml dung dịch đệm Subtrate (khơng màu), chờ 5 phút để pNPP tan hồn tồn trong dung dịch đệm. Hút 100µl cho vào mỗi giếng, dán băng keo lại. Ủ ở 37oC trong 30 phút
Bƣớc 9: đọc kết quả bằng máy đọc OD sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ
Những giếng xuất hiện màu vàng: giếng chứa mẫu bị nhiễm bệnh.
Những ơ để trống Nƣớc cất Buffer Đối chứng dƣơng Đối chứng âm Mẫu ly trích Hình 3.1: Sơ đồ bố trí phản ứng ELISA 3.4.2 Chẩn đốn TSWV bằng RT – PCR
3.4.2.1 Giai đoạn ly trích RNA theo Kit ly trích của Biorad
Bƣớc 1: Cân khoảng 60 mg mẫu lá ớt đã qua chẩn đốn ELISA cho kết quả dƣơng tính. Cho mẫu vào cối (đã qua xử lý với NaOH, EDTA, rửa lại bằng nƣớc cất siêu sạch, bọc giấy bạc rồi đem hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút, sấy khơ trong một ngày đêm) nghiền thành bột mịn với nitơ lỏng. Thêm nitơ lỏng thƣờng xuyên, khơng để cho mẫu bị nĩng lên.
Bƣớc 2: Lấy muỗng cho vào hết trong tube ly tâm 2ml cĩ nắp đậy (khơng cĩ RNase). Hịa tan mẫu bằng dung dịch ly giải (lysis solution) cĩ bổ sung PVP 2% (hỗn hợp này đã đƣợc trộn trƣớc: 14µl PVP 2% + 700µl dung dịch ly giải cho mỗi mẫu)
Bƣớc 3: Cho 700µl dung dịch đã đƣợc trộn ở bƣớc trên vào tube chứa mẫu, trộn thật kỹ bằng pipet khoảng 10 lần
Bƣớc 4: Ly tâm 13000 vịng trong 3 phút. Chuyển tồn bộ dịch nổi vào tube ly tâm 2ml mới.
Bƣớc 5: Thêm 700 µl ethanol 70%, hồ tan bằng pipet cho đến khi khơng cịn sự phân lớp
Bƣớc 6: Ủ ấm dung dịch hồ tan (elution solution) trong bồn ủ ở 70oC (để chuẩn bị cho bƣớc 15). Đặt RNA binding column (RNAbc) vào tube 2ml khơng nắp.
Bƣớc 7: Cho 700µl dung dịch ở bƣớc 5 vào RNAbc, ly tâm 12000 vịng trong 60 giây, loại bỏ dịch lọc. Thực hiện tƣơng tự cho đến hết phần dịch cịn lại.
Bƣớc 8: Dịch rửa low stringency từ 5X pha lỗng bằng ethanol 95 – 100% xuống cịn 1X
Bƣớc 9: Cho 700µl dung dịch low stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vịng trong 30 giây, loại bỏ dịch lọc
Bƣớc 10: Pha Dnase I với 250µl Tris 10mM pH 7.5. Hồ tan bằng pipet. Bƣớc 11: Trộn 5µl Dnase I với 75µl dung dịch Dnase dilution trong tube 1.5ml, cho vào RNAbc. Ủ ở nhiệt độ phịng trong 15 phút, ly tâm 30 giây. Loại bỏ dịch lọc.
Bƣớc 12: Cho 700µl high stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vịng trong 30 giây, loại bỏ dịch lọc.
Bƣớc 13: Thực hiện tƣơng tự nhƣ bƣớc 12 nhƣng với dung dịch low stringency.
Bƣớc 14: Ly tâm 12000 vịng trong 1 phút để loại bỏ hồn tồn dịch rửa. Bƣớc 15: Chuyển RNAbc vào tube 1.5ml cĩ nắp đậy, cho vào 80µl dung dịch hồ tan ở bƣớc 6. Để 1 phút, ly tâm 12000 vịng trong 2 phút để thu RNA tổng số. Bảo quản ở 4o
C.
3.4.2.2 Kiểm tra sự hiện diện của RNA bằng điện di
Bƣớc 1: Các mẫu sau khi ly trích xong, hút 2µl để chạy điện di, thấy xuất hiện các vệt băng.
Bƣớc 2: Xử lý với RNase: hút 1µl RNase cho vào tube chứa 2µl mẫu RNA tổng số vừa ly trích
3.4.2.3 Lựa chọn cặp Primer chạy RT – PCR
Primers (mồi): Dƣới đây là một số cặp primer đƣợc sử dụng trong PCR để khuếch đại một đoạn gen trong genome của virút TSWV
L1 TSWV R 5’-AAT TGC CTT GCA ACC AAT TC-3’ L2 TSWV F 5’-ATC AGT CGA AAT GGT CGG CA-3’
(J.Morris)
TSWV-CP–17F TSWV 5’ – CTCTTGATGATGCAAAGTCTGTGA– 3’ TSWV-CP–100RTSWV5’–TCTCAAAGCTATCAACTGAAGCAATAA-3’
(J.Morris)
TSWV723 CAC AAG GCA AAG ACC TTG AG 2698-2717b 620 TSWV722 GCT GGA GCT AAG TAT AGC 2098-2118c
5’ATGTCTAAGGTTAAGCTC-3
5 TTAAGCAAGTTCTGTGAG-3 )(protein vỏ)(800bp) (P. Sreerama Kumar, 2000)
Tiến trình PCR là một tiến trình rất nhạy, nếu các primer khơng đƣợc kiểm tra trƣớc về độ đặc hiệu (tức là ngồi sản phẩm chính theo mong đợi thì nĩ cịn cĩ thể khuếch đại với các lồi khác gây ức chế phản ứng PCR), ngồi ra cịn phải kiểm tra cĩ bao nhiêu vị trí trên genome mà primer cĩ thể bắt cặp đƣợc. Chính vì lý do này mà chúng ta phải kiểm tra để chọn ra cặp primer thích hợp cho việc khuếch đại bằng PCR. Cơng việc này đƣợc thực hiện bởi phần phần mềm Blast hiện cĩ trên mạng Internet. Các bƣớc thực hiện nhƣ sau:
Bƣớc 1: Vào trang chủ NCBI
Bƣớc 2: Vào Folder Blast
Bƣớc 3: Nhập trình tự của cả hai primer vào
Chú ý: Nhập nhƣ sau: Primer1 nnnnnnnnnnnnn Primer2 (lấy bổ sung và đảo đầu đối với primer2 này vì genome của con virút TSWV là RNA sợi đơn)
3.4.2.4 Khuếch đại bằng RT – PCR
RT – PCR hai bƣớc
Bƣớc 1: Reverse transcription
Thành phần hố chất
Thể tích RNA tổng số chạy thí nghiệm: 2µl; 4µl; 6µl; 8µl; 10µl
iScript Reaction Mix 4µ
iScript Reverse Transcriptase 1µ
Nuclease-free water 13µ
RNA khuơn mẫu 2µ
Chu trình nhiệt 5 phút ở 25oC 30 phút ở 42oC 5 phút ở 85oC Giữ ở 4oC Bƣớc 2: Khuếch đại bằng PCR Thành phần hố chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối iTaq buffer 10X 5µl 1X MgCl2 50mM 1.5µl 1.5mM dNTP mix 10mM 1µl 200µM iTaq DNA polymerase 0,25µl 1,25units primer 1 2µl 0,1pmol
primer 2 2µl 0,1pmol
Nuclease-free-water 33,25µl DNA đã qua Reverse 2µl Tổng thể tích 50µl
Chu trình nhiệt cho phản ứng 1 chu kỳ 5 phút ở 94o C 30 chu kỳ 1 phút ở 94oC 1 phút ở 55oC 1 phút ở 72oC 1 chu kỳ 10 phút ở 72oC Giữ ở 4oC trong 15 phút
Chú thích: Trên đây là protocol chuẩn (J.Morris), nhƣng trong quá trình tiến hành chúng tơi thấy khơng cho kết quả nên đã cĩ một số thay đổi mang tính chất thí nghiệm để tìm ra qui trình phù hợp, một số thay đổi nhƣ sau:
Hạ nhiệt độ bắt cặp từ 55oC xuống 50o
C; 48oC; 46oC
Hạ nhiệt độ bắt cặp kết hợp với tăng chu kỳ từ 30 chu kỳ lên 35 chu kỳ; 45 chu kỳ
Hạ nhiệt độ bắt cặp, tăng chu kỳ kết hợp với tăng nồng độ primers từ 5pmol lên 50pmol (đã qua tham khảo thầy cơ và bạn bè)
Tăng nồng độ MgCl2 từ 1,5µl lên 2µl; 2,5µl
Ly tâm nhẹ RNA tổng số để mong thu đƣợc nồng độ cao hơn
Tăng nồng độ Taq DNA polymerase từ 1,25U lên 2,5U RT – PCR hai bƣớc
Thành phần hố chất
Dung dịch đ ệm AMV/Tfl 5X 10µl 1X dNTP mix (10mM m ỗi lo ại dNTP) 1µl 0,2mM
MgSO4 25mM 2µl 1mM
Primer xuơi 50pmol 1µM
Primer ngƣợc 50pmol 1µM
AMV Reverse Transcriptase (5u/µ) 1µl 0,1u/µl
Tfl DNA polymerase (5u/µl) 1µl 0,1u/µl
RNA tổng số 5µl
Nuclease-free Water 28µl Tổng thể tích 50µl
Chú thích: cĩ chạy kèm đối chứng dƣơng của cơng ty Promega để kiểm tra thao tác và hoạt động của máy.
Chu trình nhiệt
1 chu kỳ 45oC trong 45 phút 1 chu kỳ 94oC trong 2 phút 45 chu kỳ 94oC trong 30 giây
50oC trong 1 phút 72oC trong 1 phút 1 chu kỳ ở 72oC trong 10 phút 1 chu kỳ ở 4oC trong 15 phút
3.4.2.5 Phƣớng pháp đổ gel agarose điện di
Bƣớc 1: Chuẩn bị gel agarose 1-2%
Bƣớc 2: Làm nguội agarose đã đƣợc nấu chín đến 50-60oC, sau đĩ đổ vào khuơn đã đƣợc đặt lƣợc vào trƣớc
Bƣớc 3: Lấy lƣợc ra, cho gel vào 1×TBE.
Bƣớc 4: Hút 2µl loading dye trộn với 4µl mẫu
Bƣớc 5: Bơm vào các giếng một cách cẩn thận 4µl mẫu + dung dịch đệm.
Bƣớc 6: Chạy điện di ở 100V/40mA, cho đến khi thuốc nhuộm cách đầu tận cùng của gel là 1cm.
Bƣớc 7: Lấy gel ra và ngâm vào dung dịch ethidium bromide (0,5Ug/ml) trong 20 phút.
Bƣớc 8: Rửa nhẹ gel với nƣớc đã qua chƣng cất.
Bƣớc 9: Đọc kết quả dƣới tia UV, thẩm định kết quả với marker.
Phần IV
Kết quả Thảo luận
4.1 Mức độ nhiễm bệnh TSWV ở 3 xã đại diện cho 3 huyện qua chẩn đốn ELISA 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo địa bàn điều tra 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo địa bàn điều tra
Bảng 4.1: Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV tại các xã: Nhuận Đức, Phƣớc Thạnh, Lộc Hƣng
12,1 12,5 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Tỉ lệ (%) Xã Nhuận Đức Phước Thạnh Lộc Hưng
Đồ thị 4.1: Tỷ lệ nhiễm virút TSWV tại các xã: Nhuận Đức,Phƣớc Thạnh, Lộc Hƣng.
Qua kết quả trên chúng tơi thấy rằng tỉ lệ nhiễm TSWV trên các địa bàn xã tại hai huyện Củ Chi (12,1%) và Châu Thành (12,5%) cịn ở mức thấp, trái lại trên địa bàn xã Lộc Hƣng huyện Trảng Bàng tỉnh Tây Ninh chƣa thấy mầm mống của virút TSWV (0%).
Địa bàn Số mẫu điều tra Số mẫu nhiễm TSWV % mẫu nhiễm TSWV
Nhuận Đức 91 11 12,1
Phƣớc Thạnh 32 4 12,5
4.1.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo từng giống ớt
Hiện tại theo nghiên cứu này chúng tơi chƣa xác định đƣợc tỷ lệ bệnh nhiễm vào từng giống ớt là do yếu tố khách quan vì rất ít hộ nơng dân nắm vững tên của giống ớt mà họ đang trồng. Đa số ngƣời dân chỉ biết là mua ớt tại cơng ty nào thơi, chứ ớt giống gì thì bà con hầu nhƣ chƣa quan tâm lắm. Dƣới đây là một số giống ớt theo chẩn đốn là đã bị nhiễm virút TSWV
Hình 4.1: Ớt Ba tri (tên ngƣời dân thƣờng gọi) bị nhiễm TSWV
4.1.3 Tỷ lệ nhiễm virút TSWV theo triệu chứng
Triệu chứng bệnh trên cây ớt là rất nhiều nhƣng qua quá trình tham khảo tài liệu cùng với phán đốn chủ quan thì chúng tơi ghi nhận lại các triệu chứng nhƣ sau:
Lá khảm vàng xanh, cong.
Hình 4.3: Ớt cĩ triệu chứng lá khảm vàng xanh, cong (hình chụp tại vƣờn của chủ hộ
Nguyễn Văn Bảnh, ấp Bầu Trịn - Nhuận Đức - Củ Chi ngày 21 tháng 3 năm 2005)
Lá chấm vàng xanh, nhăn nheo,co lại, dày, giịn
Hình 4.4: Ớt cĩ triệu chứng lá chấm vàng xanh, nhăn nheo, co lại, dày, giịn (hình chụp tại vƣờn ơng Cần, ấp Phƣớc Thuận - Phƣớc Thạnh – Châu Thành - Tiền Giang ngày 3 tháng 4 năm 2005)
Khảm nặng cĩ chấm đen, lủng lỗ
Hình 4.5: Ớt cĩ triệu chứng khảm nặng,chấm đen, lủng lỗ (hình chụp tại vƣờn ơng Huỳnh Ngọc Đạt, ấp Phƣớc Thuận – Phƣớc Thạnh – Châu Thành – Tiền Giang ngày 3 tháng 4 năm 2005)
Khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá nhỏ
Hình 4.6: Ớt cĩ triệu chứng khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá nhỏ (hình chụp tại vƣờn bà
Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng
Nhận xét: theo kết quả trên thì các triệu chứng nghi ngờ đều cĩ thể tin cậy đƣợc, bởi vì kết quả chẩn đốn bằng ELISA đều cho thấy tỉ lệ nhiễm TSWV cũng khá cao (57%). Bên cạnh đĩ cịn một điều lƣu ý là hầu nhƣ những lá bị khảm vàng đều cĩ thể đã bị nhiễm TSWV, nhƣng mức độ nặng hay nhẹ thì phải qua chẩn đốn mới cĩ kết luận chính xác. Cĩ những lá nhìn bề ngồi thì khơng thấy triệu chứng gì nhƣng khi kiểm tra vẫn phát hiện bệnh. Điều này cĩ thể lý giải là bệnh chỉ ở giai đoạn đ ầu khi virút vừa xâm nhập, chƣa đủ thời gian để biểu hiện triệu chứng ra bên ngồi.
37,5 57 53 25 0 10 20 30 40 50 60 Tỷ lệ (%) Xã Khảm vàng xanh, lá cong Lá chấm vàng xanh, nhăn, dày Khảm nặng, chấm đen, lủng lỗ
Khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá
n h ỏ
Đồ thị 4.2: Tỷ lệ bệnh theo triệu chứng
Nhƣ vậy, chúng ta thấy trong tất cả các triệu chứng trên khơng xuất hiện triệu chứng là các đốm vịng trịn đồng tâm (đây lại là triệu chứng chính của virút TSWV), nhƣng kiểm tra vẫn phát hiện bệnh. Do đĩ khơng thể chỉ dựa vào một triệu chứng là các vịng trịn đồng tâm mà phải kết hợp với các triệu chứng nêu trên mới cĩ thể chẩn đốn trên đồng ruộng một cách khá tốt rằng cây ớt cĩ bị nhiễm bệnh TSWV
Triệu chứng Số mẫu điều tra Số mẫu nhiễm % mẫu nhiễm
Khảm vàng xanh, lá cong 8 3 37,5 Lá chấm vàng xanh, nhăn, dày,giịn 7 4 57 Khảm nặng, chấm đen, lủng lỗ 15 8 53 Khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá nhỏ 8 2 25
hay khơng. Bên cạnh việc xác định bệnh trên lá, chúng tơi cũng tiến hành kiểm tra trên trái ớt, với kết quả nhƣ sau:
67% 33%
Khơng nhiễm Trái nhiễm
Đồ thị 4.3: Tỷ lệ nhiễm TSWV trên trái ớt
Từ những thực tế trên đồng ruộng cho thấy rằng: để phát hiện bệnh mà chỉ dựa vào triệu chứng là những đốm vịng trịn đồng tâm thì khĩ cĩ thể phát hiện đƣợc. Bởi vì cĩ những trái ớt cĩ triệu chứng là những vịng trịn đồng tâm nhƣng rất giống với triệu chứng của bệnh thán thƣ, nên rất khĩ phân biệt.
4.1.4 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo độ tuổi
Việc đánh giá tỉ lệ bệnh theo độ tuổi là rất khĩ và khơng thực hiện đƣợc vì khi tiến hành lấy mẫu ớt thì các vƣờn ớt đều đã vào cuối vụ, đã cho trái đợt hai.
Nhƣ chúng ta đã biết, bệnh virút là bệnh khơng điều trị đƣợc. Cây khi bị nhiễm virút thì bắt buộc phải loại bỏ, nhƣng nếu làm nhƣ vậy thì sẽ ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu quả kinh tế của các nơng hộ. Do đĩ tính cấp thiết của vấn đề là khi bệnh chƣa bùng phát thành dịch thì phải cĩ biện pháp phịng ngừa kịp thời, cĩ chiến lƣợc quản lý nguồn giống trƣớc khi đƣa vào canh tác để đem lại hiệu quả kinh tế cho bà con nơng dân.
4.2 Kết quả tiến trình RT – PCR 4.2.1 Kết quả kiểm tra RNA 4.2.1 Kết quả kiểm tra RNA
Hình 4.7: Kết quả điện di RNA
Chú thích:
+ Giếng 1: mẫu cDNA 1 đã qua bƣớc reverse transcription + Giếng 2: mẫu cDNA 2 đã qua bƣớc reverse transcription + Giếng 3: mẫu RNA 1 tổng số vừa ly trích xong
+ Giếng 4: mẫu RNA 1 đã qua xử lý RNase, ủ ở 37oC trong 1 giờ