Sau khi thực hiện Blast để kiểm tra primer thì cĩ kết quả sau:
Chỉ cĩ một vị trí gắn duy nhất trên gen đích và khơng hề cĩ vị trí gắn nào khác trên sợi bổ sung
Ngồi cá thể cần khuếch đại thì cặp primer này chỉ cĩ thể khuếch đại với một số cá thể sau:
1: AY070218
Tomato spotted wilt virus RNA-dependent RNA polymerase (L) gene, complete cds
gi|27461077|gb|AY070218.1|[27461077] 2: AB190813
Tomato spotted wilt virus RNA segment L, complete sequence gi|52421192|dbj|AB190813.1|[52421192]
3: D10066
Tomato spotted wilt virus L RNA encoding RNA polymerase, complete cds gi|222680|dbj|D10066.1|TSWLRPOLM[222680]
4: Z66548
Puumala virus segment L, genomic RNA, strain Sotkamo gi|1292880|emb|Z66548.1|PVLSOTKMO[1292880] 5: AB198742
Tomato spotted wilt virus gene for L protein, complete cds gi|57635879|dbj|AB198742.1|[57635879]
Cặp primer đã chọn
L1 TSWV R 5’-AAT TGC CTT GCA ACC AAT TC-3’ L2 TSWV F 5’-ATC AGT CGA AAT GGT CGG CA-3’
4.2.3 Kết quả tiến trình RT – PCR Kết quả RT – PCR hai bƣớc Kết quả RT – PCR hai bƣớc
Tiến trình chạy RT – PCR hai bƣớc khơng cho kết quả dƣơng tính đối với virút TSWV. Điều này theo chúng tơi cĩ thể do những nguyên nhân sau:
Genome L (long) của virút TSWV khơng cĩ đuơi polyA, nhƣ vậy sẽ rất khĩ khăn trong việc tổng hợp cDNA. Việc tổng hợp cDNA chủ yếu dựa vào các primer (mồi) ngẫu nhiên là các đoạn 6 nucleotide.
Việc tổng hợp cDNA bằng các primer nhẫu nhiên đơi khi khơng cho kết quả là những sản phẩm cĩ chứa đoạn gen cần khuếch đại
Hàm lƣợng RNA quá thấp, nên lƣợng cDNA đƣợc tạo ra cũng rất thấp. Điều này cĩ thể dẫn đến xác suất hút ra để chạy PCR đơi khi là rất thấp hoặc khơng cĩ.
Kết quả RT – PCR một bƣớc
Hình 4.8: Kết quả chạy đối chứng dƣơng
Sản phẩm đối chứng 323bp
Nhận định chung:
Sau khi chạy RT – PCR một bƣớc cĩ kèm đối chứng dƣơng thì chỉ cĩ đối chứng cho sản phẩm chỉ một băng duy nhất cịn mẫu bệnh ly trích thì khơng cho kết quả dƣơng tính. Tới đây chúng tơi mới đề xuất phƣơng án để khắc phục hiện tƣợng số lƣợng RNA khuơn mẫu quá ít là làm sao phải thiết kế đƣợc một cặp primer nữa, cặp primer này sẽ phủ bên ngồi cặp primer hiện đang dùng, mục đích là để chạy Nested PCR.