2.14.1 Phân loại RT – PCR
2.14.1.1 Phản ứng RT – PCR một bƣớc (ONE STEP)
2.14.1.2 Phản ứng RT – PCR hai bƣớc (TWO STEP)
Hình 2.8: Tiến trình thực hiện phản ứng RT – PCR hai bƣớc
(Trích từ: www.promega.com/guides/rna_guide/amplifyingrna.pdf)
2.14.2 Các phƣơng pháp đƣợc thực hiện trong phản ứng tổng hợp cDNA Gồm 2 trƣờng hợp: Gồm 2 trƣờng hợp:
Trƣờng hợp 1: Đối với các loại virút cĩ đuơi poly(A) thì sự tổng hợp
cDNA cĩ thể đƣợc thực hiện dựa vào các loại primer: oligo(dT), primer chuyên biệt cho gen cần khuếch đại và cuối cùng là primer ngẫu nhiên – các đoạn gồm 6 nucleotide
Trƣờng hợp 2: Ngƣợc lại với các loại virút khơng cĩ đuơi poly(A) thì sự
tổng hợp cDNA chỉ dựa vào các loại primer: primer chuyên biệt cho gen cần khuếch đại và primer ngẫu nhiên là các đoạn gồm 6 nucleotide
2.15 Những nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới về mức độ gây hại của TSWV 2.15.1 Những nghiên cứu tại Việt Nam 2.15.1 Những nghiên cứu tại Việt Nam
Năm 2002, tại trung tâm phân tích thí nghiệm trƣờng Đại Học Nơng Lâm TP.HCM đã cĩ nghiên cứu về TSWV nhƣng trên đối tƣợng là cây thuốc lá thì cho kết quả dƣơng tính rất yếu. Vào năm 2003 chẩn đốn lại, lần này việc chẩn đốn cho kết quả dƣơng tính rất mạnh, trên 70% mẫu thuốc lá bị nhiễm virút TSWV (Nguyễn Ngọc Bích, 2004).
Hiện tại theo chúng tơi tìm hiểu thì chƣa thấy cĩ tài liệu nào đề cập đến việc chẩn đốn TSWV trên cây ớt bằng kỹ thuật RT - PCR
2.15.2 Những nghiên cứu trên thế giới
TSWV cĩ phổ ký chủ rất rộng ở cả vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên tồn thế giới. TSWV đƣợc báo cáo đầu tiên vào năm 1915 khi nĩ gây thiệt hại rất lớn trên cà chua ở Úc, sau đĩ đƣợc mơ tả chính xác là bệnh gây ra bởi virus. Bên cạnh ớt, cà chua và các loại hoa màu chính yếu mà nhạy cảm với TSWV thì cịn cĩ họ cúc, khoai tây, đậu phụng, thuốc lá, rau diếp, và một số loại hoa màu khác. Tỉ lệ nhiễm khoảng 59- 90% điều này đƣa đến hậu quả là nĩ ảnh hƣởng lên các loại hoa màu cĩ giá trị thƣơng mại, và trong thời gian gần đây nĩ là một trong những loại virus làm ảnh hƣởng đến các loại hoa màu nhiều nhất.
Ở Brazil, mức độ nhiễm bệnh TSWV lên tới 800 lồi thực vật khác nhau.
TSWV xuất hiện trong những quốc gia trong vùng EPPO, châu Á, châu Phi, bắc Mỹ, Caribbean, nam Mỹ, Thái Bình Dƣơng, (EPPO, 1999), mức độ nhiễm hơn 900 lồi thực vật khác nhau với các lồi ký chủ ngày càng mở rộng (Peter, 1998). Xuất hiện các lồi trung gian truyền bệnh khác ở vài nƣớc Châu Âu (Mumford et al., 1996, Chatzivassiliou et al., 2000).
Tính kháng siêu mẫn cảm với TSWV đƣợc xác định bởi một gen trội đơn (allele kháng: Tsw)trong vài kiểu gen của Capsicum chinense
Phần III
Vật Liệu và Phƣơng Pháp Nghiên Cứu 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 03 năm 2005 đến giữa tháng 09 năm 2005. Địa điểm điều tra và lấy mẫu: Xã Nhuận Đức - Huyện Củ chi - Thành Phố Hồ Chí Minh; Ấp Lộc Thạnh – Xã Lộc Hƣng – Trảng Bàng – Tây Ninh; Ấp Phƣớc thuận – Xã Phƣớc Thạnh – Châu Thành - Tiền Giang. Việc chẩn đốn bệnh TSWV đƣợc tiến hành tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
3.2 Phƣơng pháp điều tra và lấy mẫu
Cơng việc lấy mẫu ớt đƣợc tiến hành nhƣ hoạch định gồm các giai đoạn sau:
Liên hệ trạm Bảo vệ Thực vật huyện điều tra tình hình về phân bố diện tích ớt trên địa bàn huyện, từ đĩ cĩ định hƣớng rõ ràng trong việc xác định vùng sẽ lấy mẫu. Sau khi liên hệ trạm Bảo vệ Thực vật huyện thì đã xác định đƣợc xã vẫn cịn trong mùa vụ trồng ớt là xã Nhuận Đức, xã Lộc Hƣng, xã Phƣớc Thạnh.
3.3 Phƣơng pháp lấy mẫu
Khi đã chọn đƣợc vƣờn để lấy mẫu thì tiến hành lấy mẫu nhƣ sau: tuỳ theo diện tích vƣờn mà cĩ thể lấy mẫu từ 5- 15 mẫu thƣờng thì lấy bốn gốc và ở giữa cịn lại lấy ngẫu nhiên và cĩ theo phán đốn cá nhân. Lấy lá khơng non cũng khơng già lắm, phiến lá lớn, cắt cho vào bọc nylon đã đƣợc ghi nhãn sẵn: chủ vƣờn, địa điểm, giống, tuổi cây, triệu chứng. (Phụ lục số 4)
Mẫu đƣợc cho vào thùng đá bảo quản lạnh ngay rồi vận chuyển về phịng thí nghiệm trữ ở - 20oC để phân tích. Bảng 3.1 trình bày số liệu về số lƣợng mẫu đƣợc thu thập tại các địa bàn.
Bảng 3.1: Các địa bàn đƣợc lấy mẫu ớt
STT Xã Mẫu lá + Trái ớt
1 Nhuận Đức 100 2 L ộc H ƣng 20 3 Ph ƣ ớc Th ạnh 40 Tổng số mẫu 160
3.4 Các phƣơng pháp chẩn đốn TSWV
3.4.1 Chẩn đốn bằng dDAS – ELISA (direct Double Antibody Sandwich – Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
Đây là phƣơng pháp dễ thực hiện nhƣng lại cho hiệu quả rất đáng tin cậy, kháng thể đƣợc sử dụng ở đây là kháng thể đơn dịng đƣợc cung cấp bởi cơng ty Biorad dùng để chẩn đốn sự hiện diện của virus TSWV gây bệnh trên cây ớt.
3.4.1.1 Dụng cụ và hố chất cần thiết cho việc chẩn đốn bằng ELISA
Dụng cụ
Cối và chày sứ nghiền mẫu (Đức) Kéo
Cân phân tích (Ohaus - Mỹ) Bình tia
Đĩa ELISA (Micriplates) 96 giếng (do cơng ty BioRad cung cấp) Hộp nhựa
Tips 100µ;1000 µl (Đức)
Micropipette P100; P1000 (Nichiryo- Nhật) Băng keo trong
Tủ định ơn (Memmert - Đức) Máy ly tâm (Hettich - Đức)
Hố chất (do cơng ty BioRad cung cấp)
Dung dịch đệm trích mẫu (Extraction buffer) Dung dịch đệm rửa (PBS - T)
Dung dịch đệm kháng thể (Coating buffer) Dung dịch đệm cơ chất (Substrate buffer)
Kháng thể đơn dịng: cung cấp bởi cơng ty Biorad Kháng thể cĩ gắn Enzyme
p-Nitrophenyl phosphate (p - NPP)
3.4.1.2 Các bƣớc thực hiện
Giai đoạn ly trích mẫu:
Mẫu khi lấy về trữ ở -20oC, chọn những lá vừa khơng non cũng khơng già, phiến lá lớn, cân 0,5g cho vào cối, thêm 2,5ml dịch trích mẫu. Nghiền thật nát vụn
chỉ thấy dạng dung dịch. Sau đĩ đổ vào eppendoff gần đầy và ghi ký hiệu thật cẩn thận.
Đem ly tâm tốc độ 5000vịng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ 4oC. Dùng Micropipette P1000 hút phần dịch nỗi sang một eppendoff 1.5ml mới và cũng ghi nhãn cẩn thận (loại bỏ cặn lắng). Trữ ở 4oC
Chẩn đốn ELISA
Bƣớc 1: Chuẩn bị đĩa và sơ đồ bố trí. Mỗi đĩa đƣợc bố trí 2 đối chứng âm và 2 đối chứng dƣơng.
Bƣớc 2: Pha lỗng kháng thể 1/250 trong dung dịch đệm (coating buffer). Trên mỗi đĩa sử dụng 60 giếng, mỗi giếng hút vào 100µl, chạy trên 5 đĩa, nhƣ vậy tổng cộng là 30ml, do đĩ phải pha dung dịch đệm là khoảng 35ml: pha lỗng 140µl kháng thể vào trong 35ml dung dịch đệm kháng thể, trộn thật kỹ trƣớc khi dùng. Hút 100µl dung dịch vừa pha vào mỗi giếng, dùng băng keo dán kín lại và đặt vào tủ ủ ở 37oC trong 2 giờ
Bƣớc 3: rửa với dung dịch đệm PBS – T bằng máy rửa, rửa 3 lần mỗi lần 3 phút
Bƣớc 4: mỗi đối chứng âm và dƣơng đƣợc hồ tan với 1ml nƣớc cất, hút 100µl mỗi loại đối chứng vào các giếng đối chứng, tiếp theo hút 100µl mẫu vào các giếng đã đƣợc bố trí. Đem ủ ở 4oC qua đêm
Bƣớc 5: Rửa lại với PBS – T 3 lần mỗi lần 3 phút.
Bƣớc 6: pha kháng thể cĩ gắn enzyme vào dung dịch đệm tƣơng tự nhƣ pha kháng thể ở bƣớc 2. Hút 100µl dung dịch kháng thể cĩ gắn enzyme đã đƣợc pha vào mỗi giếng , dán băng keo lại, sau đĩ đem ủ ở 37oC trong 2 giờ.
Bƣớc 7: rửa lại với PBS – T 3 lần, mỗi lần 3 phút.
Bƣớc 8: hồ tan pNPP trong dung dịch đệm Subtrate để đạt nồng độ cuối là 1mg/ml của pNPP
Cách pha: nghiền nát thành bột mịn 7 viên pNPP (mỗi viên 5mg), cho vào 35ml dung dịch đệm Subtrate (khơng màu), chờ 5 phút để pNPP tan hồn tồn trong dung dịch đệm. Hút 100µl cho vào mỗi giếng, dán băng keo lại. Ủ ở 37oC trong 30 phút
Bƣớc 9: đọc kết quả bằng máy đọc OD sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ
Những giếng xuất hiện màu vàng: giếng chứa mẫu bị nhiễm bệnh.
Những ơ để trống Nƣớc cất Buffer Đối chứng dƣơng Đối chứng âm Mẫu ly trích Hình 3.1: Sơ đồ bố trí phản ứng ELISA 3.4.2 Chẩn đốn TSWV bằng RT – PCR
3.4.2.1 Giai đoạn ly trích RNA theo Kit ly trích của Biorad
Bƣớc 1: Cân khoảng 60 mg mẫu lá ớt đã qua chẩn đốn ELISA cho kết quả dƣơng tính. Cho mẫu vào cối (đã qua xử lý với NaOH, EDTA, rửa lại bằng nƣớc cất siêu sạch, bọc giấy bạc rồi đem hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút, sấy khơ trong một ngày đêm) nghiền thành bột mịn với nitơ lỏng. Thêm nitơ lỏng thƣờng xuyên, khơng để cho mẫu bị nĩng lên.
Bƣớc 2: Lấy muỗng cho vào hết trong tube ly tâm 2ml cĩ nắp đậy (khơng cĩ RNase). Hịa tan mẫu bằng dung dịch ly giải (lysis solution) cĩ bổ sung PVP 2% (hỗn hợp này đã đƣợc trộn trƣớc: 14µl PVP 2% + 700µl dung dịch ly giải cho mỗi mẫu)
Bƣớc 3: Cho 700µl dung dịch đã đƣợc trộn ở bƣớc trên vào tube chứa mẫu, trộn thật kỹ bằng pipet khoảng 10 lần
Bƣớc 4: Ly tâm 13000 vịng trong 3 phút. Chuyển tồn bộ dịch nổi vào tube ly tâm 2ml mới.
Bƣớc 5: Thêm 700 µl ethanol 70%, hồ tan bằng pipet cho đến khi khơng cịn sự phân lớp
Bƣớc 6: Ủ ấm dung dịch hồ tan (elution solution) trong bồn ủ ở 70oC (để chuẩn bị cho bƣớc 15). Đặt RNA binding column (RNAbc) vào tube 2ml khơng nắp.
Bƣớc 7: Cho 700µl dung dịch ở bƣớc 5 vào RNAbc, ly tâm 12000 vịng trong 60 giây, loại bỏ dịch lọc. Thực hiện tƣơng tự cho đến hết phần dịch cịn lại.
Bƣớc 8: Dịch rửa low stringency từ 5X pha lỗng bằng ethanol 95 – 100% xuống cịn 1X
Bƣớc 9: Cho 700µl dung dịch low stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vịng trong 30 giây, loại bỏ dịch lọc
Bƣớc 10: Pha Dnase I với 250µl Tris 10mM pH 7.5. Hồ tan bằng pipet. Bƣớc 11: Trộn 5µl Dnase I với 75µl dung dịch Dnase dilution trong tube 1.5ml, cho vào RNAbc. Ủ ở nhiệt độ phịng trong 15 phút, ly tâm 30 giây. Loại bỏ dịch lọc.
Bƣớc 12: Cho 700µl high stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vịng trong 30 giây, loại bỏ dịch lọc.
Bƣớc 13: Thực hiện tƣơng tự nhƣ bƣớc 12 nhƣng với dung dịch low stringency.
Bƣớc 14: Ly tâm 12000 vịng trong 1 phút để loại bỏ hồn tồn dịch rửa. Bƣớc 15: Chuyển RNAbc vào tube 1.5ml cĩ nắp đậy, cho vào 80µl dung dịch hồ tan ở bƣớc 6. Để 1 phút, ly tâm 12000 vịng trong 2 phút để thu RNA tổng số. Bảo quản ở 4o
C.
3.4.2.2 Kiểm tra sự hiện diện của RNA bằng điện di
Bƣớc 1: Các mẫu sau khi ly trích xong, hút 2µl để chạy điện di, thấy xuất hiện các vệt băng.
Bƣớc 2: Xử lý với RNase: hút 1µl RNase cho vào tube chứa 2µl mẫu RNA tổng số vừa ly trích
3.4.2.3 Lựa chọn cặp Primer chạy RT – PCR
Primers (mồi): Dƣới đây là một số cặp primer đƣợc sử dụng trong PCR để khuếch đại một đoạn gen trong genome của virút TSWV
L1 TSWV R 5’-AAT TGC CTT GCA ACC AAT TC-3’ L2 TSWV F 5’-ATC AGT CGA AAT GGT CGG CA-3’
(J.Morris)
TSWV-CP–17F TSWV 5’ – CTCTTGATGATGCAAAGTCTGTGA– 3’ TSWV-CP–100RTSWV5’–TCTCAAAGCTATCAACTGAAGCAATAA-3’
(J.Morris)
TSWV723 CAC AAG GCA AAG ACC TTG AG 2698-2717b 620 TSWV722 GCT GGA GCT AAG TAT AGC 2098-2118c
5’ATGTCTAAGGTTAAGCTC-3
5 TTAAGCAAGTTCTGTGAG-3 )(protein vỏ)(800bp) (P. Sreerama Kumar, 2000)
Tiến trình PCR là một tiến trình rất nhạy, nếu các primer khơng đƣợc kiểm tra trƣớc về độ đặc hiệu (tức là ngồi sản phẩm chính theo mong đợi thì nĩ cịn cĩ thể khuếch đại với các lồi khác gây ức chế phản ứng PCR), ngồi ra cịn phải kiểm tra cĩ bao nhiêu vị trí trên genome mà primer cĩ thể bắt cặp đƣợc. Chính vì lý do này mà chúng ta phải kiểm tra để chọn ra cặp primer thích hợp cho việc khuếch đại bằng PCR. Cơng việc này đƣợc thực hiện bởi phần phần mềm Blast hiện cĩ trên mạng Internet. Các bƣớc thực hiện nhƣ sau:
Bƣớc 1: Vào trang chủ NCBI
Bƣớc 2: Vào Folder Blast
Bƣớc 3: Nhập trình tự của cả hai primer vào
Chú ý: Nhập nhƣ sau: Primer1 nnnnnnnnnnnnn Primer2 (lấy bổ sung và đảo đầu đối với primer2 này vì genome của con virút TSWV là RNA sợi đơn)
3.4.2.4 Khuếch đại bằng RT – PCR
RT – PCR hai bƣớc
Bƣớc 1: Reverse transcription
Thành phần hố chất
Thể tích RNA tổng số chạy thí nghiệm: 2µl; 4µl; 6µl; 8µl; 10µl
iScript Reaction Mix 4µ
iScript Reverse Transcriptase 1µ
Nuclease-free water 13µ
RNA khuơn mẫu 2µ
Chu trình nhiệt 5 phút ở 25oC 30 phút ở 42oC 5 phút ở 85oC Giữ ở 4oC Bƣớc 2: Khuếch đại bằng PCR Thành phần hố chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối iTaq buffer 10X 5µl 1X MgCl2 50mM 1.5µl 1.5mM dNTP mix 10mM 1µl 200µM iTaq DNA polymerase 0,25µl 1,25units primer 1 2µl 0,1pmol
primer 2 2µl 0,1pmol
Nuclease-free-water 33,25µl DNA đã qua Reverse 2µl Tổng thể tích 50µl
Chu trình nhiệt cho phản ứng 1 chu kỳ 5 phút ở 94o C 30 chu kỳ 1 phút ở 94oC 1 phút ở 55oC 1 phút ở 72oC 1 chu kỳ 10 phút ở 72oC Giữ ở 4oC trong 15 phút
Chú thích: Trên đây là protocol chuẩn (J.Morris), nhƣng trong quá trình tiến hành chúng tơi thấy khơng cho kết quả nên đã cĩ một số thay đổi mang tính chất thí nghiệm để tìm ra qui trình phù hợp, một số thay đổi nhƣ sau:
Hạ nhiệt độ bắt cặp từ 55oC xuống 50o
C; 48oC; 46oC
Hạ nhiệt độ bắt cặp kết hợp với tăng chu kỳ từ 30 chu kỳ lên 35 chu kỳ; 45 chu kỳ
Hạ nhiệt độ bắt cặp, tăng chu kỳ kết hợp với tăng nồng độ primers từ 5pmol lên 50pmol (đã qua tham khảo thầy cơ và bạn bè)
Tăng nồng độ MgCl2 từ 1,5µl lên 2µl; 2,5µl
Ly tâm nhẹ RNA tổng số để mong thu đƣợc nồng độ cao hơn
Tăng nồng độ Taq DNA polymerase từ 1,25U lên 2,5U RT – PCR hai bƣớc
Thành phần hố chất
Dung dịch đ ệm AMV/Tfl 5X 10µl 1X dNTP mix (10mM m ỗi lo ại dNTP) 1µl 0,2mM
MgSO4 25mM 2µl 1mM
Primer xuơi 50pmol 1µM
Primer ngƣợc 50pmol 1µM
AMV Reverse Transcriptase (5u/µ) 1µl 0,1u/µl
Tfl DNA polymerase (5u/µl) 1µl 0,1u/µl
RNA tổng số 5µl
Nuclease-free Water 28µl Tổng thể tích 50µl
Chú thích: cĩ chạy kèm đối chứng dƣơng của cơng ty Promega để kiểm tra thao tác và hoạt động của máy.
Chu trình nhiệt
1 chu kỳ 45oC trong 45 phút 1 chu kỳ 94oC trong 2 phút 45 chu kỳ 94oC trong 30 giây
50oC trong 1 phút 72oC trong 1 phút 1 chu kỳ ở 72oC trong 10 phút 1 chu kỳ ở 4oC trong 15 phút
3.4.2.5 Phƣớng pháp đổ gel agarose điện di
Bƣớc 1: Chuẩn bị gel agarose 1-2%
Bƣớc 2: Làm nguội agarose đã đƣợc nấu chín đến 50-60oC, sau đĩ đổ vào khuơn đã đƣợc đặt lƣợc vào trƣớc
Bƣớc 3: Lấy lƣợc ra, cho gel vào 1×TBE.
Bƣớc 4: Hút 2µl loading dye trộn với 4µl mẫu
Bƣớc 5: Bơm vào các giếng một cách cẩn thận 4µl mẫu + dung dịch đệm.
Bƣớc 6: Chạy điện di ở 100V/40mA, cho đến khi thuốc nhuộm cách đầu tận cùng của gel là 1cm.
Bƣớc 7: Lấy gel ra và ngâm vào dung dịch ethidium bromide (0,5Ug/ml) trong 20 phút.
Bƣớc 8: Rửa nhẹ gel với nƣớc đã qua chƣng cất.
Bƣớc 9: Đọc kết quả dƣới tia UV, thẩm định kết quả với marker.
Phần IV
Kết quả Thảo luận
4.1 Mức độ nhiễm bệnh TSWV ở 3 xã đại diện cho 3 huyện qua chẩn đốn ELISA 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo địa bàn điều tra 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo địa bàn điều tra
Bảng 4.1: Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV tại các xã: Nhuận Đức, Phƣớc Thạnh, Lộc Hƣng