4.1.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo địa bàn điều tra
Bảng 4.1: Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV tại các xã: Nhuận Đức, Phƣớc Thạnh, Lộc Hƣng
12,1 12,5 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Tỉ lệ (%) Xã Nhuận Đức Phước Thạnh Lộc Hưng
Đồ thị 4.1: Tỷ lệ nhiễm virút TSWV tại các xã: Nhuận Đức,Phƣớc Thạnh, Lộc Hƣng.
Qua kết quả trên chúng tơi thấy rằng tỉ lệ nhiễm TSWV trên các địa bàn xã tại hai huyện Củ Chi (12,1%) và Châu Thành (12,5%) cịn ở mức thấp, trái lại trên địa bàn xã Lộc Hƣng huyện Trảng Bàng tỉnh Tây Ninh chƣa thấy mầm mống của virút TSWV (0%).
Địa bàn Số mẫu điều tra Số mẫu nhiễm TSWV % mẫu nhiễm TSWV
Nhuận Đức 91 11 12,1
Phƣớc Thạnh 32 4 12,5
4.1.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo từng giống ớt
Hiện tại theo nghiên cứu này chúng tơi chƣa xác định đƣợc tỷ lệ bệnh nhiễm vào từng giống ớt là do yếu tố khách quan vì rất ít hộ nơng dân nắm vững tên của giống ớt mà họ đang trồng. Đa số ngƣời dân chỉ biết là mua ớt tại cơng ty nào thơi, chứ ớt giống gì thì bà con hầu nhƣ chƣa quan tâm lắm. Dƣới đây là một số giống ớt theo chẩn đốn là đã bị nhiễm virút TSWV
Hình 4.1: Ớt Ba tri (tên ngƣời dân thƣờng gọi) bị nhiễm TSWV
4.1.3 Tỷ lệ nhiễm virút TSWV theo triệu chứng
Triệu chứng bệnh trên cây ớt là rất nhiều nhƣng qua quá trình tham khảo tài liệu cùng với phán đốn chủ quan thì chúng tơi ghi nhận lại các triệu chứng nhƣ sau:
Lá khảm vàng xanh, cong.
Hình 4.3: Ớt cĩ triệu chứng lá khảm vàng xanh, cong (hình chụp tại vƣờn của chủ hộ
Nguyễn Văn Bảnh, ấp Bầu Trịn - Nhuận Đức - Củ Chi ngày 21 tháng 3 năm 2005)
Lá chấm vàng xanh, nhăn nheo,co lại, dày, giịn
Hình 4.4: Ớt cĩ triệu chứng lá chấm vàng xanh, nhăn nheo, co lại, dày, giịn (hình chụp tại vƣờn ơng Cần, ấp Phƣớc Thuận - Phƣớc Thạnh – Châu Thành - Tiền Giang ngày 3 tháng 4 năm 2005)
Khảm nặng cĩ chấm đen, lủng lỗ
Hình 4.5: Ớt cĩ triệu chứng khảm nặng,chấm đen, lủng lỗ (hình chụp tại vƣờn ơng Huỳnh Ngọc Đạt, ấp Phƣớc Thuận – Phƣớc Thạnh – Châu Thành – Tiền Giang ngày 3 tháng 4 năm 2005)
Khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá nhỏ
Hình 4.6: Ớt cĩ triệu chứng khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá nhỏ (hình chụp tại vƣờn bà
Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng
Nhận xét: theo kết quả trên thì các triệu chứng nghi ngờ đều cĩ thể tin cậy đƣợc, bởi vì kết quả chẩn đốn bằng ELISA đều cho thấy tỉ lệ nhiễm TSWV cũng khá cao (57%). Bên cạnh đĩ cịn một điều lƣu ý là hầu nhƣ những lá bị khảm vàng đều cĩ thể đã bị nhiễm TSWV, nhƣng mức độ nặng hay nhẹ thì phải qua chẩn đốn mới cĩ kết luận chính xác. Cĩ những lá nhìn bề ngồi thì khơng thấy triệu chứng gì nhƣng khi kiểm tra vẫn phát hiện bệnh. Điều này cĩ thể lý giải là bệnh chỉ ở giai đoạn đ ầu khi virút vừa xâm nhập, chƣa đủ thời gian để biểu hiện triệu chứng ra bên ngồi.
37,5 57 53 25 0 10 20 30 40 50 60 Tỷ lệ (%) Xã Khảm vàng xanh, lá cong Lá chấm vàng xanh, nhăn, dày Khảm nặng, chấm đen, lủng lỗ
Khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá
n h ỏ
Đồ thị 4.2: Tỷ lệ bệnh theo triệu chứng
Nhƣ vậy, chúng ta thấy trong tất cả các triệu chứng trên khơng xuất hiện triệu chứng là các đốm vịng trịn đồng tâm (đây lại là triệu chứng chính của virút TSWV), nhƣng kiểm tra vẫn phát hiện bệnh. Do đĩ khơng thể chỉ dựa vào một triệu chứng là các vịng trịn đồng tâm mà phải kết hợp với các triệu chứng nêu trên mới cĩ thể chẩn đốn trên đồng ruộng một cách khá tốt rằng cây ớt cĩ bị nhiễm bệnh TSWV
Triệu chứng Số mẫu điều tra Số mẫu nhiễm % mẫu nhiễm
Khảm vàng xanh, lá cong 8 3 37,5 Lá chấm vàng xanh, nhăn, dày,giịn 7 4 57 Khảm nặng, chấm đen, lủng lỗ 15 8 53 Khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá nhỏ 8 2 25
hay khơng. Bên cạnh việc xác định bệnh trên lá, chúng tơi cũng tiến hành kiểm tra trên trái ớt, với kết quả nhƣ sau:
67% 33%
Khơng nhiễm Trái nhiễm
Đồ thị 4.3: Tỷ lệ nhiễm TSWV trên trái ớt
Từ những thực tế trên đồng ruộng cho thấy rằng: để phát hiện bệnh mà chỉ dựa vào triệu chứng là những đốm vịng trịn đồng tâm thì khĩ cĩ thể phát hiện đƣợc. Bởi vì cĩ những trái ớt cĩ triệu chứng là những vịng trịn đồng tâm nhƣng rất giống với triệu chứng của bệnh thán thƣ, nên rất khĩ phân biệt.
4.1.4 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo độ tuổi
Việc đánh giá tỉ lệ bệnh theo độ tuổi là rất khĩ và khơng thực hiện đƣợc vì khi tiến hành lấy mẫu ớt thì các vƣờn ớt đều đã vào cuối vụ, đã cho trái đợt hai.
Nhƣ chúng ta đã biết, bệnh virút là bệnh khơng điều trị đƣợc. Cây khi bị nhiễm virút thì bắt buộc phải loại bỏ, nhƣng nếu làm nhƣ vậy thì sẽ ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu quả kinh tế của các nơng hộ. Do đĩ tính cấp thiết của vấn đề là khi bệnh chƣa bùng phát thành dịch thì phải cĩ biện pháp phịng ngừa kịp thời, cĩ chiến lƣợc quản lý nguồn giống trƣớc khi đƣa vào canh tác để đem lại hiệu quả kinh tế cho bà con nơng dân.
4.2 Kết quả tiến trình RT – PCR 4.2.1 Kết quả kiểm tra RNA 4.2.1 Kết quả kiểm tra RNA
Hình 4.7: Kết quả điện di RNA
Chú thích:
+ Giếng 1: mẫu cDNA 1 đã qua bƣớc reverse transcription + Giếng 2: mẫu cDNA 2 đã qua bƣớc reverse transcription + Giếng 3: mẫu RNA 1 tổng số vừa ly trích xong
+ Giếng 4: mẫu RNA 1 đã qua xử lý RNase, ủ ở 37oC trong 1 giờ + Giếng 5: mẫu RNA 2 tổng số vừa ly trích
+ Giếng 6: mẫu RNA 3 tổng số vừa ly trích
Nhận định chung:
+ Từ giếng số 3 và 4 cho thấy, cũng một mẫu RNA tổng số sau khi ly trích nhƣng khi đƣợc xử lý với RNase thì vệt băng mờ hẳn đi. Điều này cĩ thể phần nào khẳng định rằng trong mẫu ly trích cĩ chứa RNA tổng số nhƣng cĩ thể chƣa khẳng định đƣợc là cĩ tồn tại RNA của virút TSWV nhƣ mong muốn khơng. Ở đây sẽ cĩ một điều khĩ hiểu là tại sao RNA sợi đơn lại cĩ thể bắt đƣợc với các phân tử ethidium bromide để phát sáng dƣới tia UV, từ thắc mắt này chúng tơi đã tìm hiểu và biết rằng các phân tử ethidium bromide khơng cĩ một cơ chế bắt cặp đặc hiệu với sợi đơi DNA, ethidium bromide cĩ thể xen vào các khe hở giữa các phân tử, nĩ tồn tại ở đĩ và sẽ phát sáng dƣới tia UV (địi hỏi hàm lƣợng các phân tử phải khá cao)
+ Ở giếng 1 và giếng 2 chúng tơi tiến hành chạy sản phẩm cDNA, nhƣng khơng cho bất kỳ kết quả nào. Điều này cĩ thể giải thích: bƣớc reverse transcription để chuyển RNA thành cDNA với tổng thể tích là 20µl nhƣng chỉ chứa 2µl RNA tổng số, rồi từ 20µl cDNA đĩ ta chỉ hút 4µl để chạy điện di. Nhƣ vậy cĩ thể hàm lƣợng cDNA quá thấp chƣa tới ngƣỡng phát hiện, do đĩ khơng thể phát hiện khi nhuộm với ethidium bromide và chụp dƣới tia UV.
+ Ở giếng 5 và giếng 6 khơng thấy vệt băng xuất hiện. Điều này cĩ thể kết luận là quá trình ly trích khơng thành cơng hoặc lƣợng RNA quá ít khơng thể phát hiện đƣợc.
4.2.2 Kết quả kiểm tra Primer
Sau khi thực hiện Blast để kiểm tra primer thì cĩ kết quả sau:
Chỉ cĩ một vị trí gắn duy nhất trên gen đích và khơng hề cĩ vị trí gắn nào khác trên sợi bổ sung
Ngồi cá thể cần khuếch đại thì cặp primer này chỉ cĩ thể khuếch đại với một số cá thể sau:
1: AY070218
Tomato spotted wilt virus RNA-dependent RNA polymerase (L) gene, complete cds
gi|27461077|gb|AY070218.1|[27461077] 2: AB190813
Tomato spotted wilt virus RNA segment L, complete sequence gi|52421192|dbj|AB190813.1|[52421192]
3: D10066
Tomato spotted wilt virus L RNA encoding RNA polymerase, complete cds gi|222680|dbj|D10066.1|TSWLRPOLM[222680]
4: Z66548
Puumala virus segment L, genomic RNA, strain Sotkamo gi|1292880|emb|Z66548.1|PVLSOTKMO[1292880] 5: AB198742
Tomato spotted wilt virus gene for L protein, complete cds gi|57635879|dbj|AB198742.1|[57635879]
Cặp primer đã chọn
L1 TSWV R 5’-AAT TGC CTT GCA ACC AAT TC-3’ L2 TSWV F 5’-ATC AGT CGA AAT GGT CGG CA-3’
4.2.3 Kết quả tiến trình RT – PCR Kết quả RT – PCR hai bƣớc Kết quả RT – PCR hai bƣớc
Tiến trình chạy RT – PCR hai bƣớc khơng cho kết quả dƣơng tính đối với virút TSWV. Điều này theo chúng tơi cĩ thể do những nguyên nhân sau:
Genome L (long) của virút TSWV khơng cĩ đuơi polyA, nhƣ vậy sẽ rất khĩ khăn trong việc tổng hợp cDNA. Việc tổng hợp cDNA chủ yếu dựa vào các primer (mồi) ngẫu nhiên là các đoạn 6 nucleotide.
Việc tổng hợp cDNA bằng các primer nhẫu nhiên đơi khi khơng cho kết quả là những sản phẩm cĩ chứa đoạn gen cần khuếch đại
Hàm lƣợng RNA quá thấp, nên lƣợng cDNA đƣợc tạo ra cũng rất thấp. Điều này cĩ thể dẫn đến xác suất hút ra để chạy PCR đơi khi là rất thấp hoặc khơng cĩ.
Kết quả RT – PCR một bƣớc
Hình 4.8: Kết quả chạy đối chứng dƣơng
Sản phẩm đối chứng 323bp
Nhận định chung:
Sau khi chạy RT – PCR một bƣớc cĩ kèm đối chứng dƣơng thì chỉ cĩ đối chứng cho sản phẩm chỉ một băng duy nhất cịn mẫu bệnh ly trích thì khơng cho kết quả dƣơng tính. Tới đây chúng tơi mới đề xuất phƣơng án để khắc phục hiện tƣợng số lƣợng RNA khuơn mẫu quá ít là làm sao phải thiết kế đƣợc một cặp primer nữa, cặp primer này sẽ phủ bên ngồi cặp primer hiện đang dùng, mục đích là để chạy Nested PCR.
4.2.4 Kết quả tiến trình thiết kế primer cho Nested PCR
Sự cần thiết phải chọn giải pháp RT – PCR kết hợp Nested PCR
Bƣớc chẩn đốn virút TSWV bằng phƣơng pháp ELISA cho kết quả dƣơng tính rất yếu, điều này cĩ thể do lƣợng virút nhiễm (RNA khuơn mẫu) rất thấp, khĩ cĩ thể phát hiện bằng PCR với một cặp Primer. Do đĩ phải dùng phƣơng pháp Nested PCR
Bƣớc thiết kế Primer dùng cho Nested PCR
Để đảm bảo sản phẩm PCR sau cùng khơng thay đổi về kích thƣớc, chúng tơi tiến hành thiết kế một cặp primer mới (ứng dụng phần mềm PCGEN), cặp primer này sẽ phủ bên ngồi cặp primer cũ. Nhƣ vậy qua bƣớc PCR thứ nhất với cặp primer mới sẽ tạo ra sản phẩm cĩ kích thƣớc lớn hơn sản phẩm mong đợi. Từ đây ta trích ra một thể tích để chạy tiếp PCR với cặp primer cũ và cĩ thể thu đƣợc sản phẩm PCR với kích thƣớc mong đợi.
Sau khi tiến hành thiết kế primer bằng phần mềm PCGEN cho việc chạy Nested PCR, chúng tơi đã thiết kế đƣợc rất nhiều primer đơn bắt vào sợi sense, primer đơn bắt vào sợi antisense, cặp primer bắt vào cả hai sợi với các thơng số địi hỏi đƣợc đƣa ra nhƣ sau:
Các thơng số về primer
Chiều dài primer tối ƣu là 20bp
Chiều dài primer chấp nhận đƣợc là từ 15 – 25bp
Độ lặp lại của các base đơn tối đa là 3 lần
Số lƣợng base GC ở đầu 3’ là 2
% GC chấp nhận đƣợc: 40 – 60%
Các thơng số gắn kết của primer
Vùng cuộn lại (stem – loop) cĩ thể chấp nhận đƣợc tối đa là 4
% các base tối đa mà cĩ thể bắt cặp bổ sung với các vùng trên các khuơn mẫu khác là 70%
Thơng số về nhiệt độ nĩng chảy (Tm)
Tm tối ƣu: 64oC
Dãy Tm chấp nhận đƣợc: 49 – 79
Các primer đơn đạt chuẩn về thành phần và vị trí gắn đối với sợi (+)
|STT |Trình tự primer (5' --> 3') | bp | Tm | delG | %GC |Vùng bắt cặp | P1 | CATGTAGCGCAGAGTGATCCATCGG | 25 | 64 | -53 | 56 | 187-211 | | P2 | AGCGCAGAGTGATCCATCGGAAGC | 24 | 65 | -54 | 58 | 192-215 | | P3 | TAGCGCAGAGTGATCCATCGGAAGC | 25 | 65 | -55 | 56 | 191-215 | | P4 | TGTAGCGCAGAGTGATCCATCGG | 23 | 62 | -50 | 57 | 189-211 | | P5 | ATGTAGCGCAGAGTGATCCATCGG | 24 | 62 | -51 | 54 | 188-211 | | P6 | CGCAGAGTGATCCATCGGAAGC | 22 | 61 | -49 | 59 | 194-215 | | P7 | CATGTAGCGCAGAGTGATCCATCG | 24 | 61 | -50 | 54 | 187-210 | | P8 | GCAGAGTGATCCATCGGAAGCC | 22 | 60 | -49 | 59 | 195-216 | | P9 | AGCGCAGAGTGATCCATCGGAAGCC | 25 | 68 | -57 | 60 | 192-216 | | P10 | GTAGCGCAGAGTGATCCATCGG | 22 | 59 | -48 | 59 | 190-211 | | P11 | ATGTAGCGCAGAGTGATCCATCG | 23 | 59 | -48 | 52 | 188-210 | | P12 | TGCTTGAATTTGTCATGTCCAAGG | 24 | 59 | -49 | 42 | 26-49 | | P13 | ATGCTTGAATTTGTCATGTCCAAGG | 25 | 59 | -50 | 40 | 25-49 | | P14 | GCAGATGCTTGAATTTGTCATGTCC | 25 | 59 | -50 | 44 | 21-45 | | P15 | AGCGCAGAGTGATCCATCGG | 20 | 58 | -46 | 60 | 192-211 | | P16 | TAGCGCAGAGTGATCCATCGG | 21 | 58 | -47 | 57 | 191-211 | | P17 | TGTAGCGCAGAGTGATCCATCG | 22 | 58 | -47 | 55 | 189-210 | | P18 | CAGAGTGATCCATCGGAAGCC | 21 | 57 | -46 | 57 | 196-216 | | P19 | GCAGAGTGATCCATCGGAAGC | 21 | 57 | -46 | 57 | 195-215 | | P20 | ACGTTATCTTTGGACACAATCACG | 24 | 56 | -47 | 42 | 256-279 | | P21 | TACGTTATCTTTGGACACAATCACG | 25 | 56 | -48 | 40 | 255-279 | | P22 | CATCGGAAGCCATATCTATAAGTGG | 25 | 56 | -50 | 44 | 206-230 | | P23 | GTAGCGCAGAGTGATCCATCG | 21 | 56 | -45 | 57 | 190-210 |
| P24 | GCTTGAATTTGTCATGTCCAAGG | 23 | 56 | -47 | 43 | 27-49 | | P25 | CAGATGCTTGAATTTGTCATGTCC | 24 | 56 | -47 | 42 | 22-45 | | P26 | CGTTATCTTTGGACACAATCACG | 23 | 55 | -46 | 43 | 257-279 | | P27 | ATCGGAAGCCATATCTATAAGTGG | 24 | 54 | -48 | 42 | 207-230 | | P28 | AGAGTGATCCATCGGAAGCC | 20 | 54 | -44 | 55 | 197-216 | | P29 | AGCGCAGAGTGATCCATCG | 19 | 54 | -43 | 58 | 192-210 | | P30 | TAGCGCAGAGTGATCCATCG | 20 | 54 | -44 | 55 | 191-210 | | P31 | TCGGAAGCCATATCTATAAGTGG | 23 | 53 | -47 | 43 | 208-230 | | P32 | CAGAGTGATCCATCGGAAGC | 20 | 53 | -43 | 55 | 196-215 | | P33 | GAGTGATCCATCGGAAGCC | 19 | 52 | -42 | 58 | 198-216 | | P34 | CTTGAATTTGTCATGTCCAAGG | 22 | 52 | -44 | 41 | 28-49 | | P35 | GATGCTTGAATTTGTCATGTCC | 22 | 52 | -43 | 41 | 24-45 | | P36 | CATGTAGCGCAGAGTGATCC | 20 | 51 | -42 | 55 | 187-206 | | P37 | GTTATCTTTGGACACAATCACG | 22 | 50 | -42 | 41 | 258-279 | | P38 | AGTGATCCATCGGAAGCC | 18 | 50 | -41 | 56 | 199-216 | | P39 | AGAGTGATCCATCGGAAGC | 19 | 49 | -41 | 53 | 197-215 | | P40 | TGAATTTGTCATGTCCAAGG | 20 | 49 | -40 | 40 | 30-49 | | P41 | TGCTTGAATTTGTCATGTCC | 20 | 49 | -40 | 40 | 26-45
Các primer đạt chuẩn về thành phần và vị trí gắn đối với sợi (-)
| STT |Trình tự primer (5' --> 3') | bp | Tm | delG | %GC |Vùng bắt cặp | M1 | GCCTGCAATAGAGAGGAATAATCGC | 25 | 59 | -53 | 48 | 923-947 | | M2 | TGCCTGCAATAGAGAGGAATAATCG | 25 | 59 | -51 | 44 | 924-948 | | M3 | TGCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC | 25 | 58 | -51 | 44 | 920-944 | | M4 | CCTGCAATAGAGAGGAATAATCGC | 24 | 56 | -50 | 46 | 923-946 | | M5 | GCCTGCAATAGAGAGGAATAATCG | 24 | 56 | -50 | 46 | 924-947