Nuôi khuẩn lạc trắng đã chọn bằng colony-PCR mang gen GA2ox1 (có băng có kích thƣớc khoảng 1,4kb) trong 3ml môi trƣờng LB lỏng rồi tách phục vụ cho việc xác định trình tự. Tế bào đƣợc thu bằng cách ly tâm, rồi hoà tan trong TELT, lysozym đƣợc bổ sung nhằm phá vỡ màng tế bào vi khuẩn. Bổ sung izopropanol làm kết tủa ADN, protein. Làm sạch ADN bằng cồn 80%. Sau đó ủ với ARNase trong 2 giờ để loại hết ARN. Cuối cùng, plasmit tiếp tục đƣợc tinh sạch để đọc trình tự nucleotit. Plasmit tinh sạch đƣợc điện di kiểm tra trên gel agrarose 0,8%.
Kết quả điện di trên hình 3.16 cho thấy, các mẫu ADN plasmit tinh sạch đều có các băng rõ nét, đảm bảo chất lƣợng và số lƣợng để tiến hành đọc trình tự nucleotit của đoạn GA2ox1.
Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR M. Thang ADN chuẩn 1kb; 1-3. Dòng R4.05
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.16. Kết quả điện di plasmit tinh sạch chứa đoạn gen GA2ox1
Để khẳng định lại các plasmit cần tìm có gắn đoạn gen sản phẩm PCR hay không, chúng tôi đã chọn ADN plasmit đã tinh sạch của mẫu thí nghiệm để tiến hành cắt bằng enzym giới hạn BamHI ở 370C trong 2 giờ. Vị trí của enzym này trong vector là nằm ở hai đầu đoạn gắn. Theo lý thuyết, nếu phản ứng cắt enzym xảy ra thành công thì sẽ thu đƣợc 2 phân đoạn ADN có kích thƣớc khoảng 2700bp là của vector pBT và phần còn lại của gen GA2ox1 khoảng 1240bp.
Kết quả phân tích bằng enzym giới hạn cho thấy plasmit pBT tái tổ hợp mang đoạn ADN đã xen đƣợc vào, với kích thƣớc phân tử tƣơng đƣơng với sản phẩm PCR (hình 3.17).
Hình 3.17 cho thấy, sau khi phản ứng cắt bằng enzym giới hạn BamHI xảy ra và điện di trên gel agarose 0,8%, mẫu nghiên cứu có 2 băng, băng trên có kích thƣớc khoảng 2,7kb tƣơng ứng với kích thƣớc của vector, và băng dƣới có kích thƣớc khoảng 1,24kb tƣơng đƣơng với kích thƣớc của đoạn gen GA2ox1. Nhƣ vậy, đoạn gen GA2ox1 đã đƣợc tách dòng và đủ điều kiện để tiến hành đọc trình tự.
Hình 3.17. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmit tái tổ hợp bằng enzym BamHI 1. Thang ADN chuẩn; 2. Dòng R4.05
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn