tổ hợp mang gen GA2ox1
Sau khi tiến hành phản ứng PCR và chạy điện di trên gel agarose 1% để xác định băng có kích thƣớc khoảng 1,24kb, băng này đƣợc cắt và làm sạch ADN từ bản gel để thu sản phẩm ADN sạch. ADN có chứa đoạn gen GA2ox1 đƣợc gắn vào vector tách dòng pBT sử dụng bộ kit pGEM-T System (hình 3.13). Đây là vector cải biến từ vector pUC-18 đƣợc thiết kế tại Viện Công nghệ sinh học (Phan Trọng Hoàng & CS., 2005) [9].
Hình 3.13. Sơ đồ vector pBT đƣợc cải biến từ vector pUC18
Trộn lẫn vector pBT với sản phẩm PCR dƣới tác dụng của enzym T4 ligase, vector tái tổ hợp đƣợc tạo thành.
Hình 3.12. Kết quả PCR nhân gen GA2ox1 với cặp mồi EX2-3-F và EX2-3-R 1. Thang ADN chuẩn; 2. Dòng R4.05
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Vector tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt. Sản phẩm biến nạp đƣợc nuôi phục hồi trong môi trƣờng LB đặc có bổ sung 100mg/l ampicillin (Ap) và X-gal 0,004‰, IPTG 100μM. Trên môi trƣờng chọn lọc này, các khuẩn lạc có chứa vector tái tổ hợp sẽ có màu trắng và các khuẩn lạc không chứa vector tái tổ hợp sẽ có màu xanh (hình 3.14).
Hình 3.14. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp và tế bào khả biến E.coli DH5α Những khuẩn lạc xanh xuất hiện là do vector pBT lac-operon hoạt động bình thƣờng, không có đoạn gen lạ nào chèn vào, khi có chất cảm ứng của IPTG sẽ tổng hợp enzym-galactosidase, enzym này sẽ chuyển hoá cơ chất X-gal thành hợp chất có màu xanh. Còn những khuẩn lạc trắng có thể là do nhận đƣợc plasmit mang lac operon không hoạt động. Chính vì vậy, khi có chất cảm ứng IPTG thì gen không tổng hợp enzym -galactosidase và không xảy ra sự chuyển hoá X-gal. Lac operon bị bất hoạt là do đoạn ADN ngoại lai xen vào giữa promoter của operon gen lacZ. Chính vì vậy lac operon không thể điều khiển gen cấu trúc phiên mã, nên không có sự dịch mã thành enzym đƣợc. Các khuẩn lạc trắng mang plasmit tái tổ hợp đƣợc chọn bằng phƣơng pháp colony-PCR để phục vụ cho bƣớc tiếp theo.
Chúng tôi chọn 3 khuẩn lạc trắng riêng rẽ để tiến hành phản ứng colony-PCR với cặp mồi pUC18, xác định khuẩn lạc có plasmit mang đoạn gen GA2ox1. Vì 2 mồi này nằm trên vector tách dòng có chiều dài 200bp, nên nếu khuẩn lạc có plasmit mang đoạn gen GA2ox1, thì sản phẩm PCR sẽ cho một băng có kích thƣớc khoảng 1,4kb. Sản phẩm colony-PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% (hình 3.15).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trên hình 3.15 cho thấy, sản phẩm colony-PCR của các khuẩn lạc đều cho kết quả dƣơng tính, các mẫu đều có một băng duy nhất kích thƣớc khoảng 1,4kb. Nhƣ vậy, kết quả bƣớc đầu đã chọn đƣợc dòng plasmit mang gen GA2ox1 tái tổ hợp. Các dòng mang plasmit có gen GA2ox1 đƣợc nhân lên để tách plasmit.