cDNA của gen CCR và biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5
Sản phẩm thôi gel sau khi tinh sạch được gắn vào vector tách dòng pENTRTM/D– TOPO dựa vào sự hình thành mối liên kết hydro giữa 4 nucleotide CACC đầu 5’của sản phẩm PCR với 4 nucleotide GTGG đầu 3’ trên vector và nhờ enzyme topoisomerase (TOPO) ở trên vector nối các đầu
của sản phẩm PCR vào vector mà plasmid tái tổ hợp pENTR/CCR được tạo thành (thành phần phản ứng được trình bày ở mục 2.2.8.1 và bảng 2.10).
Sản phẩm gắn pENTR/CCR được biến nạp vào tế bào khả biến E.Coli
DH5bằng phương pháp sốc nhiệt để dòng hóa và nhân nhanh plasmid với số lượng lớn. Kết quả ghép nối được thể hiện ở sản phẩm biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli DH5 (hình 3.20).
Hình 3.20. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pENTR/CCR vào tế bào khả biến E.Coli DH5
Vì plasmid pENTR/CCR có gen kháng kháng sinh Kanamycin còn tế bào khả biến E.Coli DH5 không kháng bất kì kháng sinh nào nên khi biến nạp có các trường hợp sau xảy ra:
- Các tế bào không chứa plasmid tái tổ hợp sẽ không mọc được trên môi trường có chứa kháng sinh kanamycine.
- Các tế bào chứa plasmid pENTR nhưng chưa gắn cDNA của gen CCR vẫn có khả năng mọc trên môi trường chọn lọc.
- Các tế bào có chứa vector tái tổ hợp pENTR/CCR có khả năng mọc được trên môi trường chọn lọc
Từ kết quả thu được biểu hiện trên hình 3.20 có thể kết luận sơ bộ rằng đã biến nạp thành công vector tái tổ hợp pENTR/CCR vào tế bào khả biến
plasmid tái tổ hợp. Vấn đề đặt ra là trong những khuẩn lạc thu được, khuẩn lạc nào mang vector chứa đoạn cDNA của gen CCR mong muốn còn nguyên vẹn. Do đó để kiểm tra sự có mặt của đoạn cDNA này trong các dòng khuẩn lạc chúng tôi tiến hành tách chiết và cắt plasmid.