CAD2
Kết quả phân tích trình tự nucleotide ở cả hai đoạn promoter CAD1 và CAD2 cho thấy, hai đoạn promoter tách dòng được có kích thước đúng so với dự tính khi thiết kế mồi. Từ kết quả cho thấy đây chính là các trình tự promoter dự kiến. Đoạn promter tách dòng được có chiều dài lần lượt là 987 bp và 1149 bp. Như vậy nghiên cứu này đã bước đầu thành công trong việc tách dòng và xác định trình tự promter EuCAD.
Từ kết quả đọc trình tự và so sánh với trình tự nucleotide của gen CAD đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế, chúng tôi khẳng định đã tách dòng được hai đoạn promoter từ gen CAD. Từ kết quả kể trên chúng tôi thực hiện phản ứng nối hai đoạn DNA này sử dụng phản ứng PCR với cặp mồi sử dụng là CADpro1-F và CADpro2-R. Kết quả của phản ứng nối được kiểm tra trên gel agarose 0,8%; hình 3.12:
Hình 3.12: Kết quả điện di kiểm tra phản ứng nối hai đoạn promoter CAD1 và CAD2
Giếng M: Thang DNA 1 kb; Giếng 1: Đoạn CAD1; Giếng 2: Đoạn CAD2; Giếng 3: Sản phẩm nối
Từ kết quả điện di cho thấy đã thu được một băng kích thước khoảng 2043 bp, phù hợp với kích thước dự tính. Như vậy có thể kết luận chúng tôi đã tách dòng thành công và hoàn chỉnh promoter EuCAD. Đoạn promoter này sẽ được dùng để thiết kết cấu trúc vector chuyển vào cây để kiểm tra hoạt động và vị trí biểu hiện của gen ở tầng xylem do promoter này điều khiển.
3.3.6. Phân tích các nhân tố điều hòa dạng cis có mặt trong trình tự của promoter gen CAD tách dòng được từ bạch đàn nâu Eucalyptus urophylla promoter gen CAD tách dòng được từ bạch đàn nâu Eucalyptus urophylla S.T Blake
Sau khi có được trình tự của đoạn DNA chúng tôi đã tiến hành so sánh trình tự này với trình tự gen CAD của cây bạch đàn gunnii kết quả được thể hiện trên hình 3.13:
Hình 3.13: Kết quả so sánh trình tự DNA với gen CAD của E. gunnii
Từ kết quả so sánh cho thấy đoạn trình tự promoter thu được nằm trùng với vị trí của promoter của gen CAD của cây bạch đàn gunnii ở vị trí từ [- 2143] đến [- 382] bp, điều này cho phép bước đầu kết luận đây chính là promoter của gen CAD của cây bạch đàn urô. Và để khẳng định điều này chúng tôi tiến hành phân tích trình tự DNA thu được nhằm tìm ra các trình tự
(motif) tham gia vào quá trình điều hòa hoạt động của gen ở các điều kiện và giai đoạn phát triển nhất định của cây. Từ các công bố trước đây các nhà khoa học đã phát hiện được các trình tự đặc trưng của promoter tham gia vào quá trình điều hòa sinh tổng hợp lignin ở thực vật như các trình tự Myb hay Zinc
finger [16]. Để thực hiện được công việc này chúng tôi đã sử dụng cơ sở dữ
liệu phân tích chuyên dụng PLACE (Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements) (Higo và cộng sự, 1999). Kết quả phân tích thể hiện ở hình 3.14:
Từ kết quả phân tích này, có thể nhận thấy rằng promoter của gen CAD tách dòng được từ cây bạch đàn nâu Eucalyptus urophylla S.T Blake có mang đầy đủ các trình tự đặc trưng của một promoter điển hình như CAATBOX, GATABOX, TATABOX. Đặc biệt trong đó chúng tôi phát hiện được các trình tự có vai trò điều hòa hoạt động của các gen ở tầng xylem và các gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp lignin như đã được công bố bởi các nhà khoa học khác như MYB1AT, MYBPLANT [16]. Những phân tích tin sinh học trên đây là cơ sở lý thuyết rất tốt cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm thiết kế vector chuyển gen có mang đoạn promoter mà chúng tôi đã tách dòng thành công trong nghiên cứu này với mục đích cuối cùng là điều khiển quá trình sinh tổng hợp lignin ở các đối tượng cây rừng quan tâm.