Để chắc chắn rằng các đoạn promoter CAD1 và CAD2 có mặt trong các dòng khuẩn lạc thu được chúng tôi tiến hành phản ứng colony-PCR. Phương pháp này giúp chúng ta phát hiện nhanh những dòng khuẩn lạc nào mang gen mục tiêu, giảm chi phí và tiết kiệm thời gian. Tiến hành phản ứng với 11 khuẩn lạc trắng cho mỗi đĩa khuẩn lạc, sau đó thực hiện phản ứng colony- PCR với các cặp mồi pUC18F1 và pUC18R1 để chọn dòng khuẩn lạc mang đoạn promoter CAD1 và CAD2. Sở dĩ trong thí nghiệm này chúng tôi không dùng các cặp mồi CADpro1 và CADpro2 là do khi thực hiện phản ứng ghép nối sản phẩm PCR được sử dụng với một lượng lớn. Ngoài những đoạn DNA quan tâm đã được gắn vào vector còn có rất nhiều đoạn DNA còn dư thừa,
chúng tồn tại bên trong hoặc xung quanh các khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch khi biến nạp. Vì vậy khi thực hiện phản ứng colony-PCR với các cặp mồi CADpro1 và CADpro2 thì chúng ta vẫn có thể thu được các băng vạch có kích thước mong muốn tuy nhiên trên thực tế các đoạn promoter CAD1 và CAD2 có thể chưa được gắn vào vector. Mồi pUC18 được thiết kế nằm trên vector pBT và ở hai phía đối với đoạn cắt đa điểm. Khoảng cách giữa hai mồi trên vector này khoảng 200bp. Do đó khi tiến hành phản ứng colony-PCR thì đối với các khuẩn lạc trắng do vector tự đóng vòng thì sẽ thu được băng có kích thước khoảng 200bp, còn với plasmid tái tổ hợp sẽ chứa các đoạn chèn có kích thước thực tế bằng kích thước băng điện di trừ đi 200 bp (kích thước đoạn nằm trên vector). Sản phẩm colony-PCR được điện di trên gel 0,8%, kết quả điện di được thể hiện trên hình 3.7:
Hình 3.7: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc
Giếng M: Thang DNA 1 kb; Giếng 1 – 11: Các dòng khuẩn lạc
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR trên hình 3.7 cho thấy có 10 dòng khuẩn lạc cho kết quả dương tính, các mẫu đều có băng duy nhất kích thước khoảng 1187 bp kết quả này phù hợp với kích thước dự tính và có 1 dòng khuẩn lạc âm tính, như vậy hiệu suất biến nạp là khá cao. Như vậy, kết quả bước đầu đã chọn được dòng plasmid mang đoạn promoter CAD1 tái tổ
hợp. Các dòng mang plasmid có đoạn promoter CAD1 được nhân lên để tách plasmid.
Cũng làm tương tự với đĩa khuẩn chứa đoạn promoter CAD2 :
Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc
Giếng M: Thang DNA 1 kb; Giếng 1 – 11: Các dòng khuẩn lạc
Kết quả điện di trên hình 3.8 cho thấy dòng khuẩn lạc số 6 xuất hiện băng DNA có kích thước vào khoảng 1349 bp đúng với kích thước đã tính toán. Như vậy bước đầu khẳng định dòng khuẩn lạc số 6 mang plasmid tái tổ hợp có chứa đoạn promoter CAD2.
Từ kết quả thu được chúng tôi tiến hành nuôi khuẩn trên môi trường LB lỏng và tách plasmid.