3.2.1. Vật liệu
Hợp chất chiết xuất từ các thảo dược ký hiệu là B2 thuộc họ Fabaceae, L, L2 và M thuộc họ Asteraceae.
3.2.2. Đối tượng nghiên cứu
- Tôm sú không mang các mầm bệnh để bố trí thí nghiệm, trọng
lượng bình quân từ 15 – 20 g/con.
- Giống vi khuẩn V. harveyi thuần chủng, phân lập từ tôm bệnh.
3.2.3. Dụng cụ và hóa chất 3.2.3.1. Dụng cụ 3.2.3.1. Dụng cụ
- Dụng cụ bố trí thí nghiệm: bể nuôi, hệ thống sục khí, vợt thùng,
thau...
- Dụng cụ thu mẫu: kim tiêm (1 ml), đèn cồn, que cấy, bông thấm,
găng tay, bao thùng xốp, chai lọ.
- Dụng cụ phân tích vi khuẩn: ống nghiệm các loại, đĩa petri, que
cấy, đèn cồn, pipet, đầu típ, tủ lạnh, tủ ấm, tủ cấy, nồi hấp autoclave...
- Dụng cụ quan sát, thử nghiệm kháng sinh đồ: thước đo vòng kháng
khuẩn, đĩa giấy tẩm hợp chất chiết xuất làm kháng sinh đồ.
- Dụng cụ kiểm tra chất lượng nước: nhiệt kế thủy ngân 0 – 1000C, pH kế, bộ test NH3, DO, COD...
3.2.3.2. Môi trường và hóa chất
Đĩa giấy tẩm các hợp chất cần thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau.
- Môi trường TCBS (Thiosulfate Citrate Bile salts Sucrose agar):
môi trường đặc trưng dùng để chọn lọc V. harveyi.
- TSB (Tryptone Soya Broth): môi trường tăng sinh, phục hồi cho vi
khuẩn.
- Môi trường BHIA (Brain Heart Infusion Agar): môi trường dùng để tăng sinh, làm thuần vi khuẩn.
- Môi trường MHA (Mueller Hinton Agar): môi trường đặc trưng dùng làm kháng sinh đồ khảo sát tác dụng kháng khuẩn của hợp chất thử nghiệm.
- Các môi trường và hóa chất thử nghiệm đặc tính sinh hóa của vi khuẩn.
Ngoài ra còn có nước biển (15‰) và một số hóa chất khác dùng trong thí nghiệm.
3.3. Phương pháp tiến hành
Nội dung tiến hành đề tài có thể chia thành 2 giai đoạn thử nghiệm:
3.3.1. Thử nghiệm trong phạm vi phòng thí nghiệm
Tiến hành thử nghiệm tác dụng của các hợp chất B2, L, L2 và M theo phương pháp kháng sinh đồ. Mục tiêu là sàng lọc các chất có hiệu quả và xác định các mức nồng độ có ý nghĩa của chất đó đối với vi khuẩn V. harveyi trong phòng thí nghiệm. Gồm các bước sau:
Sơ đồ 1. Bố trí thử nghiệm tác dụng của các hợp chất
Phân lập dòng thuần V. harveyi từ
tôm có dấu hiệu nhiễm khuẩn
Thử nghiệm sinh hóa để xác định
V. harveyi Thử nghiệm tác dụng của các chất bằng phương pháp kháng sinh đồ Xác định nồng độ có hiệu quả kháng vi khuẩn
3.3.1.1. Phân lập dòng thuần Vibrio harveyi
- Lấy mẫu: chọn ngẫu nhiên 2-3 con tôm nuôi ao có dấu hiệu nhiễm
khuẩn.
- Lấy máu tôm: mỗi con 0,1 ml, sau đó nhỏ lên các đĩa cấy chứa môi
trường TCBS, dàn đều khắp bề mặt môi trường, mỗi con cấy lên 1 đĩa. Ủ trong tủ ấm ở 300C trong 24 giờ.
- Chọn khuẩn lạc phát sáng trên môi trường TCBS cấy chuyền sang
môi trường BHIA (có bổ sung 2% NaCl). Ủ trong tủ ấm ở 300C, 24 giờ để thuần hóa và tăng sinh V. harveyi.
- Tiến hành thử nghiệm các đặc tính sinh hoá của V. harveyi: khả năng sử dụng các đường glucose, sorbitol, malnose, sucrose, lactose, galactose; khả năng sử dụng citrate như nguồn carbone duy nhất trên môi trường Simons Citrate Agar; khả năng sinh gas từ glucose, kiểm tra khả năng lên men và oxy hoá; khả năng phân giải Gelatin; khả năng sử dụng Nitrate; phản ứng Indol hoá; khả năng sử dụng các acid amin (Jonh, 1994).
3.3.1.2. Phương pháp kháng sinh đồ theo phương pháp Mc Farland (Bauer và Kirby, 1997) và Kirby, 1997)
Nguyên tắc
Khả năng ức chế của các hợp chất thảo dược được xác định dựa vào đường kính vòng vô khuẩn hình thành do sự khuếch tán các hợp chất xung quanh đĩa giấy tẩm hợp chất. Hiệu quả kháng khuẩn được xác định dựa vào đường kính của các vòng ức chế vi khuẩn.
Cách tiến hành
Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn theo phương pháp Mc Farland.
Ống số 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
BaCl2 1%(ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
H2SO4 1%(ml) 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9,0
Tb/ml(x 108) 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
Chuẩn bị vi khuẩn để thử nghiệm kháng sinh đồ: giống vi khuẩn V. harveyi thuần chủng. Vi khuẩn được cấy tăng sinh trên môi trường BHIA + 2% NaCl, thu tế bào vi khuẩn và huyền phù với nước muối sinh lý 2% vô trùng.
Pha hỗn hợp dịch tế bào của vi khuẩn sao cho dung dịch huyền phù có cùng độ đục với ống số 3 theo Mc Farland.
- Chuẩn bị các đĩa giấy (đường kính = 6mm) trong điều kiện vô
trùng. Hòa tan các hợp chất thảo dược trong dung môi DMSO với các nồng độ dự kiến thử nghiệm tùy vào mức độ tan của các hợp chất trong dung môi. Cụ thể, các nồng độ cho từng hợp chất là:
+ Hợp chất B2: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 và 100 µg/µl. + Hợp chất L: 600, 700, 800, 900, và 1000 µg/µl.
+ Hợp chất L2: 600, 700, 800, 900 và 1000 µg/µl. + Hợp chất M: 200, 300, 400, 500, 600 và 700 µg/µl.
- Dùng pippet hút 5 µl các hợp chất cần thử nghiệm tẩm vào các đĩa giấy.
- Chuẩn bị các đĩa môi trường MHA để thử kháng sinh đồ.
- Dùng pipet hút 0,5 ml dung dịch vi khuẩn cho vào môi trường
MHA trong đĩa petri, dàn đều dịch vi khuẩn lên đĩa thạch. Sau đó dùng pipet
hút hết phần dung dịch vi khuẩn thừa trên mặt thạch.
- Dùng kẹp vô khuẩn lấy các đĩa giấy đã tẩm các hợp chất hợp chất
thử nghiệm đặt lên bề mặt thạch, cách mép đĩa petri khoảng 2,5 cm, đảm bảo mặt đĩa giấy tẩm hợp chất tiếp xúc phẳng với bề mặt thạch.
- Ủ các đĩa petri trong tủ ấm ở 300C sau các khoảng thời gian 4 giờ, 8 giờ và 12 giờ kiểm tra và đo vòng vô khuẩn.
Sau giai đoạn thử nghiệm trong phòng thí nghiệm, bước đầu đánh giá hợp chất M là có hiệu quả nhất đối với V. harveyi. Giai đoạn tiếp theo là tiến hành thí nghiệm đánh giá hiệu quả điều trị của hợp chất M đối với tôm đã cho nhiễm V.harveyi trong bể nuôi trong phòng Wet-lab. Hai nồng độ của hợp chất M được chọn để thử nghiệm là 500 và 750 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày. Sơ đồ tiến hành thử nghiệm được trình bày như sau:
Tôm không mang các mầm bệnh Lô đối chứng âm, 15 con Lô đối chứng dương, 15 con Lô thử nghiệm nồng độ 500 mg/kg, 15 con Lô thử nghiệm nồng độ 750 mg/kg, 15 con Tiêm 0,05 ml nước muối sinh lý Tiêm 0,05 ml dịch vi khuẩn Tiêm 0,05 ml dịch vi khuẩn Tiêm 0,05 ml dịch vi khuẩn
Theo dõi biểu hiện của tôm
Chăm sóc, theo dõi, đánh giá hiệu quả của thuốc đối với vi khuẩn
Cho tôm ăn thức ăn có tẩm
thuốc nồng độ 750 mg/kg Cho tôm ăn
thức ăn có tẩm thuốc nồng độ 500 mg/kg Cho tôm ăn thức ăn thường Cho tôm ăn thức ăn thường
Sơ đồ 2. Bố trí thử nghiệm trong phòng Wet-lab
Chuẩn bị 15 bể thí nghiệm, nước biển sau khi kiểm tra các tính chất hóa lý được cho vào mỗi bể 50 lít. Thí nghiệm bố trí thành 4 lô:
- Lô đối chứng âm: bố trí 3 bể, không gây cảm nhiễm, chỉ tiêm
0,05 ml dung dịch nước muối sinh lý và cho ăn thức ăn tổng hợp không tẩm hợp chất thử nghiệm.
- Lô đối chứng dương: bố trí 3 bể, các con tôm được gây cảm
nhiễm 0,05 ml dung dịch vi khuẩn (106 CFU/ml) và sử dụng thức ăn tổng hợp không tẩm hợp chất thử nghiệm.
- Lô thử nghiệm tác dụng của thuốc ở nồng độ 500 mg/kg: bố trí
3 bể, các con tôm được gây cảm nhiễm 0,05 ml dung dịch vi khuẩn (106 CFU/ml) và cho ăn thức ăn tổng hợp có tẩm hợp chất M với nồng độ 500 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày.
- Lô thử nghiệm tác dụng của thuốc ở nồng độ 750
mg/kg: bố trí 3 bể, các con tôm được gây cảm nhiễm 0,05 ml dung dịch vi khuẩn (106 CFU/ml) và cho ăn thức ăn tổng hợp có tẩm hợp chất M với nồng độ 750 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày.
Các con tôm sau khi tiêm được thả lại bể theo đúng bố trí. Chăm sóc và quan sát các dấu hiệu biểu hiện bệnh bằng cách so sánh với đối chứng âm và đối chứng dương. Quan sát theo dõi các biểu hiện của tôm, bắt đầu cho tôm ăn thức ăn có tẩm thuốc ngay khi có biểu hiện bệnh.
Trong kỹ thuật nuôi tôm, vấn đề chất lượng nước nuôi rất quan trọng. Nước nuôi tôm phải có các tính chất hoá lý phù hợp với tôm, nếu không có thể làm tôm bị sốc và chết. Vì vậy trước khi thả tôm, cần phải tiến hành kiểm tra các tính chất hoá lý của nước nuôi.
Phương pháp kiểm tra các tính chất hoá lý của nước:
- Đo độ mặn của nước biển bằng máy đo độ mặn.
- Đo pH: dùng pH meter cầm tay để đo pH.
- NH3/: sử dụng bộ test NH3 của Sera.
- Đo COD: dùng KMnO4 để oxy hóa các chất hữu cơ, sau đó dùng
KI trung hòa KMnO4 dư và chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,01N với chỉ thị hồ tinh bột.
- Đo DO: dùng MnCl2 và KI/NaOH để cố định mẫu nước và
chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,01N với chỉ thị hồ tinh bột.
Trong quá trình nuôi phải thường xuyên theo dõi và kiểm tra để đảm bảo chất lượng của nước nuôi tôm.
3.3.2.2. Tiến hành thu mẫu và kiểm tra vi khuẩn
Tiến hành lấy mẫu nước và mẫu tôm tại các thời điểm:
- Trước khi gây cảm nhiễm.
- Khi gây cảm nhiễm.
- Sau 7 ngày dùng thuốc.
- Sau 10 ngày dùng thuốc.
- Sau 14 ngày dùng thuốc.
Kiểm tra vi khuẩn trong mẫu nước
Lấy mỗi bể khoảng 25 ml nước, các mẫu nước của các bể cùng lô thị nghiệm được trộn lại đựng trong bình nhựa để mang về phân tích. Mẫu nước đem về phòng thí nghiệm sẽ được kiểm tra bằng cách trải cho thật khô trên các đĩa thạch chứa môi trường TCBS, mỗi lô sẽ cấy 3 đĩa: 2 đĩa cấy với 50 µl mẫu nước và một đĩa cấy với 100 µl mẫu nước.
Kiểm tra vi khuẩn trong tôm
- Mỗi lần lấy mẫu bắt khoảng 3 con ở mỗi bể.
- Tiến hành lấy mẫu máu tôm của từng con (0,1 ml).
- Sau đó mẫu máu của từng con sẽ được cấy trải lên 1 đĩa thạch
chứa môi trường TCBS. Ủ trong tủ ấm ở 300C trong 24 giờ.
- Xác định các khuẩn lạc nghi ngờ là các khuẩn lạc màu lục, khi
quan sát trong tối thấy phát sáng.
- Cấy vi khuẩn sang môi trường BHIA + 2% NaCl, ủ trong tủ ấm
ở 300C trong 24 giờ để tăng sinh khối vi khuẩn.
- Kiểm tra các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn: khả năng sử dụng
các đường glucose, sorbitol, manitol, sucrose, lactose, galactose; khả năng sử dụng citrate như nguồn carbone duy nhất trên môi trường Simons Citrate Agar; khả năng sinh gas từ glucose; khả năng phân giải Gelatin; khả năng khử Nitrate; phản ứng Indol hoá; khả năng sử dụng các acid amin như arginine, lysine, ornitine; phản ứng với esculine; khả năng sử dụng tinh bột; phản ứng VP và phản ứng O/F (Jonh, 1994).
3.3.3. Phương pháp phân tích số liệu thống kê
Các số liệu thí nghiệm được xử lý sử dụng phần mềm thống kê SPSS và EXCEL. SPSS là một chương trình phân tích số liệu tự động do máy tính thực hiện dựa trên các công thức toán học đã được lập trình.
Các công thức toán học thường dùng trong phân tích thống kê (Nguyễn Văn Đức, 2001):
• Trung bình (Mean):
• Phương sai (Variance): S2
∑
n i=1 Xi X = n1 (Xi– X)2∑
n i=1 n-1 1 S2 = X• Độ lệch chuẩn (Standard deviation): S
Trong thí nghiệm này:
- Xi là giá trị của các vòng kháng khuẩn ở các nồng độ thí nghiệm (mm).
- n là số lần lập lại thí nghiệm.
Phương pháp so sánh 2 giá trị nghiệm thức (Nguyễn Văn Đức, 2001):
Ở đây mỗi nghiệm thức là các giá trị vòng kháng khuẩn ở mỗi nồng độ ở mỗi điểm thời gian.
Cách tiến hành:
Đặt giả thiết H0: m1 = m2
Xi = X1i – X2i
Từ giá trị của phân phối Student t suy ra p là mức độ sai khác ý nghĩa dựa vào bảng phân bố t.
- Nếu p > 0,05, chấp nhận giả thuyết H0 tức là hai giá trị không khác nhau về mặt thống kê.
- Nếu p ≤ 0,05, không chấp nhận giả thuyết H0 tức là hai giá trị
khác nhau về mặt thống kê.
∑
n i=1Xi X = n1 (Xi – X)2∑
n i=1 n-1 1 S2 =√
S2/n |X| t(n-1) =Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả thử nghiệm trong phòng thí nghiệm 4.1.1 Kết quả phân lập dòng thuần Vibrio harveyi
Kết quả phân lập từ các mẫu máu của các con tôm nghi ngờ bệnh thấy xuất hiện các khuẩn lạc nghi ngờ và kết quả kiểm tra các đặc tính sinh hóa đã xác định đây là V.
harveyi. Vi khuẩn này được dùng cho các thí nghiệm về sau.
Bảng 4.1. Kết quả các phản ứng sinh hoá định danh V. harveyi
Đặc điểm sinh hóa V. harveyi
Màu khuẩn lạc Vàng Gram - Đối chứng - Arginine - Lysine + Ornitine +
Glucose + Gasglucose - Galactose - Lactose - Sucrose + Sorbitol - Manitol + Gelatin + Indol - VP - O/F +/+ Esculine + Citrate + Tinh bột + Khử Nitrate +
4.1.2. Kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ
Qua bước đầu sàng lọc với độ lập lại 5 lần, kết quả ghi nhận như sau (Bảng 4.2):
- Cả 3 hợp chất L, L2 và M đều có tác dụng kháng khuẩn đối với
V. harveyi ở tất cả các nồng độ thử nghiệm, trong đó hợp chất M có hiệu quả
cao hơn so với L và L2 ở các khoảng thời gian sau 4, 8 và 12 giờ.
- Hợp chất B2 không có tác dụng đối với V. harveyi.
- Dung môi hòa tan DMSO không có tác dụng đối với V. harveyi.
Bảng 4.2. Kết quả tác dụng của các hợp chất ở các khoảng thời gian
Khoảng thời gian B2 L L2 M
4 giờ - + ++ +++
8 giờ - + ++ +++
12 giờ - + ++ +++
Ghi chú: (+): hiệu quả thấp; (++): hiệu quả vừa; (+++): hiệu quả cao; (-): không có hiệu quả.
4.1.3. Kết quả thử nghiệm hợp chất M
Sau khi sàng lọc, hợp chất M có hiệu quả nhất. Vì thế, bước thử nghiệm tiếp theo là lập lại thí nghiệm kháng sinh đồ cho hợp chất M với số lần lập lại 25 lần. Và kết quả được trình bày trong Bảng 4.5.
Kết quả cho thấy tất cả các nồng độ thử nghiệm của hợp chất M đều có tác dụng đối
với V. harveyi. Tuy nhiên hiệu quả tác dụng ở mỗi nồng độ có sự sai khác ý nghĩa (p <
0,05) sau các khoảng thời gian 4 giờ, 8 giờ và 12 giờ, nhìn chung đường kính vòng vô khuẩn ở mỗi nồng độ tăng sau các khoảng thời gian 4 giờ, 8 giờ và 12 giờ (Bảng 4.4).
Bảng 4.3. So sánh hiệu quả của hợp chất M qua các khoảng thời gian ở từng nồng độ thử nghiệm
Nồng độ (µg/µl)
Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Sau 4 giờ (1) Sau 8 giờ (2) Sau 12 giờ (3) 200 12,95 ± 0,44 13,30 ± 0,48 14,75 ± 1,36
p(1)&(2) = 0,010; p(1)&(3) = 0,000; p(2)&(3) = 0,000 300 14,02 ± 0,44 14,67 ± 0,48 15,41 ± 1,16
p(1)&(2) = 0,000; p(1)&(3) = 0,000; p(2)&(3) = 0,020 400 14,82 ± 0,38 15,18 ± 0,50 15,91 ± 0,50
p(1)&(2) = 0,006; p(1)&(3) = 0,000; p(2)&(3) = 0,000 500 14,89 ± 0,50 15,27 ± 0,64 15,93 ± 0,76
p(1)&(2) = 0,049; p(1)&(3) = 0,000; p(2)&(3) = 0,005 600 14,98 ± 0,45 15,37 ± 0,54 16,12 ± 0,77
p(1)&(2) = 0,008; p(1)&(3) = 0,000; p(2)&(3) = 0,001 700 15,28 ± 0,48 15,90 ± 0,50 16,41 ± 0,83
p(1)&(2) = 0,010; p(1)&(3) = 0,000; p(2)&(3) = 0,004
Sự khác biệt về hiệu quả giữa các nồng độ được trình bày trong Bảng 4.5:
