bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm trong tương lai
Ngày nay, với những thành tựu vượt bậc của mình, công nghệ sinh học đang dần dần chiếm lĩnh một vị trí quan trọng trong thế giới loài người. Có thể nói vai trò của công nghệ sinh ngày càng trở nên không thể thiếu, nó chính là một công cụ đắc lực giúp cho con người tìm hiểu và khám phá ra được những điều bí mật trong thế giới sinh học nhằm cải thiện chất lượng cuộc sống và hoạt động sản xuất của con người ngày càng tốt hơn. Những lĩnh vực như nông nghiệp, y tế, thực phẩm… có sự tham gia của công nghệ sinh học đang từng bước được hoàn thiện. Chính vì thế, trong tương lai, đây sẽ là một
lĩnh vực được con người chú ý đến nhiều nhất, thế kỷ XXI sẽ là một thế kỷ của công nghệ sinh học.
Trong lĩnh vực nông nghiệp nói chung, cũng như hoạt động sản xuất thủy sản nói riêng, công nghệ sinh học đã và đang thể hiện vai trò của mình trong việc nghiên cứu và ứng dụng các thành tựu nghiên cứu vào các vấn đề như kỹ thuật sản xuất, chất lượng giống, việc kiểm soát dịch bệnh… nhằm cải thiện việc sản xuất cũng như chất lượng của sản phẩm, góp phần thúc đẩy nền kinh tế của xã hội loài người phát triển đi lên một cách bền vững.
Từ khi dịch bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm bùng nổ, đã có nhiều công trình nghiên cứu được tiến hành nhằm kiểm soát và ngăn chặn dịch bệnh này, trong đó đã có nhiều kết quả nghiên cứu đã được ứng dụng vào trong hoạt động sản xuất thực tiễn. Các nhà khoa học nhìn nhận trong thời gian sắp tới việc ứng dụng của công nghệ sinh học vào việc giải quyết vấn đề bệnh phát sáng trên tôm sẽ tập trung vào hai hướng chính đó là: các phương pháp chẩn đoán phát hiện bệnh và các sản phẩm để ngăn chặn, kiểm soát dịch bệnh.
2.5.1. Ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc chẩn đoán phát hiện bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm
Các kỹ thuật chẩn đoán phát hiện bệnh trên tôm ngày nay đã có nhiều tiến bộ nhờ việc áp dụng các thành tựu nghiên cứu của công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ sinh học phân tử. Việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện bệnh trên tôm đã trở nên phổ biến và được sử dụng rộng rãi ở nhiều nơi. Các kỹ thuật như ELISA và PCR đã được sử dụng để phát hiện các bệnh phổ biến trên tôm, đặc biệt là các bệnh do virus như bệnh đốm trắng do WSSV, bệnh đầu vàng… Ưu điểm của các phương pháp này là tính chính xác và rút ngắn được thời gian phát hiện. Đã có mhiều đề xuất về sử dụng các kỹ thuật như ELISA và PCR cho việc phát hiện nhanh bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm. Việc tìm các đoạn DNA và tạo ra các kháng thể bắt dính kháng nguyên đặc trưng của Vibrio đã được nhiều nhà khoa học tiến hành nghiên cứu. Năm 1998, Robertson và ctv đã nghiên cứu tạo ra một kháng thể đa dòng từ thỏ có thể dùng để phát hiện nhiều dòng V. harveyi. Theo các phương pháp này thời gian phát hiện bệnh được
rút ngắn rất nhiều. Tuy nhiên, hiện nay tại nhiều nơi trên thế giới, người ta vẫn chủ yếu sử dụng phương pháp phân lập vi khuẩn để phát hiện bệnh phát sáng do chi phí để thực hiện phương pháp này thấp hơn các phương pháp ELISA và PCR. Do hạn chế về tính kinh tế nên đây sẽ là một hướng không khả thi trong thời gian sắp tới.
2.5.2. Ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc tạo ra các chế phẩm dùng trong ngăn chặn và điều trị bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm
Kinh nghiệm nuôi tôm cho thấy việc phòng ngừa bệnh là một giải pháp hữu hiệu nhất giúp phát triển bền vững nghề nuôi tôm. Vì thế đây sẽ là một hướng hứa hẹn có nhiều triển vọng trong tương lai, chủ yếu tập trung vào việc nghiên cứu tìm ra các vaccine và chế phẩm sinh học để ngăn chặn dịch bệnh.
Theo những hiểu biết từ trước đến nay, tôm sú là động vật bậc thấp có hệ miễn dịch không đặc hiệu. Điều này có nghĩa là việc sử dụng vacxin ở tôm sẽ không hiệu quả (Đào Văn Trí và ctv, 2001).
Một đối tượng khác trong hướng nghiên cứu này là chế phẩm sinh học. Hiện nay trên thị trường đã xuất hiện nhiều loại chế phẩm sinh học có khả năng ức chế các loài Vibrio như Zymetin, Dikaku, Biodream… Sự ra đời của các chế phẩm sinh học sẽ giúp hạn chế được việc sử dụng các loại hóa chất và kháng sinh trong nuôi tôm. Trong chế phẩm sinh học, tính cạnh tranh ức chế của các loài sinh vật giữ một vai trò rất quan trọng quyết định tới hiệu quả của loại chế phẩm đó. Điều này đã thúc đẩy các nhà nghiên cứu tập trung tìm ra các loài sinh vật có khả năng ức chế Vibrio. Và hiện nay, đối tượng nghiên cứu đang được tập chung vào các sinh vật sống ở biển có khả năng ức chế Vibrio gây hại.
Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có một dòng vi khuẩn ở biển là
Pseudomonas I-2 có thể tạo ra các hợp chất ức chế chống lại các Vibrio gây bệnh trên
tôm bao gồm V. harveyi, V. fluvialis, V. parahaemolyticus, V. damsela và V. vulnificus.
Đây là một hợp chất có trọng lượng phân tử thấp, bền với nhiệt, có thể hòa tan trong chloroform và chịu được các enzyme phân giải protein. Người ta tiến hành tách chiết chất này từ vi khuẩn bằng chloroform và tiến hành thử nghiệm, kết quả cho thấy dịch chiết đã làm giảm mật độ V. harveyi trong nước xuống khi dùng ở nồng độ 20 µg/µl và
không ảnh hưởng tới ấu trùng của tôm thậm chí ở nồng độ 50 µg/µl. Vì vậy dòng
Pseudomonas I-2 này sẽ có tiềm năng ứng dụng vào việc kiểm soát các Vibrio gây bệnh
trên tôm trong các hệ thống sản xuất thủy sản (Karunasagar, 2001).
Alteromonas sp. P7 là một vi khuẩn gram âm, di động, hình que, có cytochrome
oxidase, có khả năng tổng hợp chất sắc tố trong môi trường nước biển. Chúng có khả năng phát triển ở nồng độ muối NaCl 6% và không phát triển trên môi trường agar có chứa sucrose, muối mật, thiosulphate citrate, trên môi trường Mac Conkey, hoặc trên môi trường không có NaCl. Vi khuẩn này không có khả năng phát sáng, không có enzyme amylase, gelatinase, catalase, urease và không khả năng tạo vòng indole cũng như biến đổi nitrate. Alteromonas sp. P7 có thể sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất và không có khả năng sử dụng các nguồn carbon khác như là arabinose, dextrose, galactose, lactose, mannitol, sorbitol và sucrose. Với những đặc điểm này, người ta đã xếp vi khuẩn này vào loài Alteromonas và được chỉ định là Alteromonas sp. P7 (Abraham, 2004).
Người ta đã phân lập Alteromonas sp. P7 từ các ấu trùng Fabricius của tôm sú và nhận thấy chúng có khả năng chống lại V. harveyi. Tất cả các dòng V. harveyi phân lập được bị ức chế theo các mức độ khác nhau bởi Alteromonas sp. P7 ở trong phòng thí nghiệm. Hợp chất kháng khuẩn được tạo ra bởi Alteromonas sp. P7 có thể hòa tan trong dung môi hữu cơ và bám dính chặt lên bề mặt của các tế bào vi khuẩn và hợp chất này không bị phân hủy khi xử lý bằng trypsin (Okereke và Montville, 1991). Từ đó, người ta cho rằng hợp chất này có thể không phải là các protein có trong tự nhiên mặc dù các dòng Alteromonas xác địnhđã được báo cáo là sản xuất các hợp chất protein kháng khuẩn (Mc Carthy, 1994). Các chất kháng khuẩn được thải ra ngoài là sản phẩm của quá trình biến dưỡng thứ cấp. Người ta cho rằng các chất kháng khuẩn này có thể là một pyrole hoặc quinolinol hoặc tyrosol và isatin hoặc là một đường đa có khả năng tan trong ethyl acetate (T. J. Abraham, 2004).
Các thí nghiệm được tiến hành đã chỉ ra rằng Alteromonas sp. P7 giúpgiảm rõ rệt tỷ lệ chết ở ấu trùng tôm sú in vivo từ V. harveyi M3 bằng cách ngăn chặn sự phát triển và sinh sản của các vi khuẩn gây bệnh (Abraham, 2004).
Gần đây, tại nhiều nơi trên thế giới đã nổi lên các đề tài nghiên cứu về khả năng ứng dụng của phage trong lĩnh vực thủy sản. Fraser (2003) và một số nhà khoa học khác đã nghiên cứu và phát hiện một loại phage có khả năng gây sinh tan chuyên biệt cho V.
harveyi. Việc sử dụng các bacteriaphage chuyên biệt chống lại V. harveyi ngay từ đầu
trong quy trình sản xuất sẽ giúp giảm tối thiểu mật độ hiện diện của V. harveyi trong nước, chất cặn và trong ruột vật nuôi và như thế sẽ ngăn chặn được sự phát sinh của dịch bệnh. Tuy nhiên việc sử dụng phage có các mặt hạn chế như tạo ra các dòng vi khuẩn mới kháng lại phage, hoặc bản thân các phage đó khó có thể kiểm soát được, cũng như tính độc của các phage đó cần phải xác định rõ ràng. Trước khi đưa vào ứng dụng trong thực tiễn, chúng ta cần phải tiếp tục tiến hành nhiều nghiên cứu khác để bảo đảm tính hiệu quả và an toàn của phage trong sản xuất.
Tóm lại, hướng ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc sản xuất ra các loại chế phẩm dùng để ngăn chặn dịch bệnh phát sáng sẽ có nhiều triển vọng trong thời gian tới. Tuy nhiên vẫn còn tồn tại một mặt hạn chế của các loại chế phẩm này, đó là giá thành của nó quá cao, điều này giải thích vì sao hiện nay nhiều hộ nông dân nuôi tôm vẫn còn cử dụng hóa chất và kháng sinh để xử lý bệnh tôm. Điều này thúc đẩy các nhà sản xuất nghiên cứu, tìm ra một kỹ thuật, một quy trình sản xuất mới để có thể sản xuất đại trà với số lượng lớn nhằm hạ giá thành sản phẩm, đáp ứng được nhu cầu và nguyện vọng của người nuôi tôm.
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm 3.1.1. Thời gian
Từ 21/03/2005 đến 26/06/2005.
3.1.2. Địa điểm
- Phòng Bệnh học Thủy sản – Trung tâm Quan trắc – Viện Nghiên
cứu Nuôi trồng Thủy sản II.
- Trại Thực nghiệm nuôi Thủy sản Thủ Đức – Viện Nghiên cứu
Nuôi trồng Thủy sản II.
3.2. Vật liệu và đối tượng nghiên cứu3.2.1. Vật liệu 3.2.1. Vật liệu
Hợp chất chiết xuất từ các thảo dược ký hiệu là B2 thuộc họ Fabaceae, L, L2 và M thuộc họ Asteraceae.
3.2.2. Đối tượng nghiên cứu
- Tôm sú không mang các mầm bệnh để bố trí thí nghiệm, trọng
lượng bình quân từ 15 – 20 g/con.
- Giống vi khuẩn V. harveyi thuần chủng, phân lập từ tôm bệnh.
3.2.3. Dụng cụ và hóa chất 3.2.3.1. Dụng cụ 3.2.3.1. Dụng cụ
- Dụng cụ bố trí thí nghiệm: bể nuôi, hệ thống sục khí, vợt thùng,
thau...
- Dụng cụ thu mẫu: kim tiêm (1 ml), đèn cồn, que cấy, bông thấm,
găng tay, bao thùng xốp, chai lọ.
- Dụng cụ phân tích vi khuẩn: ống nghiệm các loại, đĩa petri, que
cấy, đèn cồn, pipet, đầu típ, tủ lạnh, tủ ấm, tủ cấy, nồi hấp autoclave...
- Dụng cụ quan sát, thử nghiệm kháng sinh đồ: thước đo vòng kháng
khuẩn, đĩa giấy tẩm hợp chất chiết xuất làm kháng sinh đồ.
- Dụng cụ kiểm tra chất lượng nước: nhiệt kế thủy ngân 0 – 1000C, pH kế, bộ test NH3, DO, COD...
3.2.3.2. Môi trường và hóa chất
Đĩa giấy tẩm các hợp chất cần thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau.
- Môi trường TCBS (Thiosulfate Citrate Bile salts Sucrose agar):
môi trường đặc trưng dùng để chọn lọc V. harveyi.
- TSB (Tryptone Soya Broth): môi trường tăng sinh, phục hồi cho vi
khuẩn.
- Môi trường BHIA (Brain Heart Infusion Agar): môi trường dùng để tăng sinh, làm thuần vi khuẩn.
- Môi trường MHA (Mueller Hinton Agar): môi trường đặc trưng dùng làm kháng sinh đồ khảo sát tác dụng kháng khuẩn của hợp chất thử nghiệm.
- Các môi trường và hóa chất thử nghiệm đặc tính sinh hóa của vi khuẩn.
Ngoài ra còn có nước biển (15‰) và một số hóa chất khác dùng trong thí nghiệm.
3.3. Phương pháp tiến hành
Nội dung tiến hành đề tài có thể chia thành 2 giai đoạn thử nghiệm:
3.3.1. Thử nghiệm trong phạm vi phòng thí nghiệm
Tiến hành thử nghiệm tác dụng của các hợp chất B2, L, L2 và M theo phương pháp kháng sinh đồ. Mục tiêu là sàng lọc các chất có hiệu quả và xác định các mức nồng độ có ý nghĩa của chất đó đối với vi khuẩn V. harveyi trong phòng thí nghiệm. Gồm các bước sau:
Sơ đồ 1. Bố trí thử nghiệm tác dụng của các hợp chất Phân lập dòng thuần V. harveyi từ
tôm có dấu hiệu nhiễm khuẩn
Thử nghiệm sinh hóa để xác định
V. harveyi Thử nghiệm tác dụng của các chất bằng phương pháp kháng sinh đồ Xác định nồng độ có hiệu quả kháng vi khuẩn
3.3.1.1. Phân lập dòng thuần Vibrio harveyi
- Lấy mẫu: chọn ngẫu nhiên 2-3 con tôm nuôi ao có dấu hiệu nhiễm
khuẩn.
- Lấy máu tôm: mỗi con 0,1 ml, sau đó nhỏ lên các đĩa cấy chứa môi
trường TCBS, dàn đều khắp bề mặt môi trường, mỗi con cấy lên 1 đĩa. Ủ trong tủ ấm ở 300C trong 24 giờ.
- Chọn khuẩn lạc phát sáng trên môi trường TCBS cấy chuyền sang
môi trường BHIA (có bổ sung 2% NaCl). Ủ trong tủ ấm ở 300C, 24 giờ để thuần hóa và tăng sinh V. harveyi.
- Tiến hành thử nghiệm các đặc tính sinh hoá của V. harveyi: khả năng sử dụng các đường glucose, sorbitol, malnose, sucrose, lactose, galactose; khả năng sử dụng citrate như nguồn carbone duy nhất trên môi trường Simons Citrate Agar; khả năng sinh gas từ glucose, kiểm tra khả năng lên men và oxy hoá; khả năng phân giải Gelatin; khả năng sử dụng Nitrate; phản ứng Indol hoá; khả năng sử dụng các acid amin (Jonh, 1994).
3.3.1.2. Phương pháp kháng sinh đồ theo phương pháp Mc Farland (Bauer và Kirby, 1997) và Kirby, 1997)
Nguyên tắc
Khả năng ức chế của các hợp chất thảo dược được xác định dựa vào đường kính vòng vô khuẩn hình thành do sự khuếch tán các hợp chất xung quanh đĩa giấy tẩm hợp chất. Hiệu quả kháng khuẩn được xác định dựa vào đường kính của các vòng ức chế vi khuẩn.
Cách tiến hành
Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn theo phương pháp Mc Farland.
Ống số 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
BaCl2 1%(ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
H2SO4 1%(ml) 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9,0
Tb/ml(x 108) 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
Chuẩn bị vi khuẩn để thử nghiệm kháng sinh đồ: giống vi khuẩn V. harveyi thuần chủng. Vi khuẩn được cấy tăng sinh trên môi trường BHIA + 2% NaCl, thu tế bào vi khuẩn và huyền phù với nước muối sinh lý 2% vô trùng.
Pha hỗn hợp dịch tế bào của vi khuẩn sao cho dung dịch huyền phù có cùng độ đục với ống số 3 theo Mc Farland.
- Chuẩn bị các đĩa giấy (đường kính = 6mm) trong điều kiện vô
trùng. Hòa tan các hợp chất thảo dược trong dung môi DMSO với các nồng độ dự kiến thử nghiệm tùy vào mức độ tan của các hợp chất trong dung môi. Cụ thể, các nồng độ cho từng hợp chất là:
+ Hợp chất B2: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 và 100 µg/µl. + Hợp chất L: 600, 700, 800, 900, và 1000 µg/µl.
+ Hợp chất L2: 600, 700, 800, 900 và 1000 µg/µl. + Hợp chất M: 200, 300, 400, 500, 600 và 700 µg/µl.
- Dùng pippet hút 5 µl các hợp chất cần thử nghiệm tẩm vào các đĩa giấy.
- Chuẩn bị các đĩa môi trường MHA để thử kháng sinh đồ.
- Dùng pipet hút 0,5 ml dung dịch vi khuẩn cho vào môi trường
MHA trong đĩa petri, dàn đều dịch vi khuẩn lên đĩa thạch. Sau đó dùng pipet hút hết phần dung dịch vi khuẩn thừa trên mặt thạch.
- Dùng kẹp vô khuẩn lấy các đĩa giấy đã tẩm các hợp chất hợp chất
thử nghiệm đặt lên bề mặt thạch, cách mép đĩa petri khoảng 2,5 cm, đảm bảo