Nghiên cứu này được thực hiện bởi A.C.Lee và Y.Fujio vào năm 1998. Mẫu bánh men được lấy từ một cơ sở sản xuất tại Việt Nam để phân tích các chỉ tiêu như điều kiện pH, độ ẩm, nấm mốc, nấm men. Theo nghiên cứu, bánh men có pH acid giá trị khoảng 5.76, độ ẩm 13.6%, tổng số tế bào nấm mốc và nấm men lần lượt vào khoảng 1,3.106 và 4,3.106 cfu/g mẫu tươi. Nấm mốc được phân lập chủ yếu là Rhizopus
oryzae, Mucor indicus, Mucor circillinoides, Amylomyces rouxii. Nấm men được phân
lập là Saccharomyces cerevisiae, Hyphopichia burtonii, Saccharomycopsis buligera,
Pichia anomala, và Candida sp.
Tổng cộng 12 mẫu bánh men khác nhau sử dụng trong thức uống và thực phẩm lên men của nhiều miền quê ở Việt Nam được thu thập để làm mẫu thí nghiệm. Các loại bánh men này được gói kín trong các bao bì bằng nhựa plastic, được dán nhãn và lưu trữ ở nơi khô ráo trước khi đem về làm thí nghiệm.
pH của bánh men được xác định bằng cách khuấy trộn 5g bột bánh men với 25ml nước cất. Sau đó dùng thiết bị đo pH (HORIBA D-14) để xác định pH.
Độ ẩm được xác định bằng cách sấy khô một lượng bánh men ở 130oC đến khối lượng không đổi, đọc giá trị cho mỗi lần làm thí nghiệm.
Phân lập nấm mốc: 5g bột nấm men trộn với 25ml nước cất đem vô trùng, khuấy đều tạo hệ lơ lửng. Dùng pipette hút 0.1ml dịch lơ lửng trải đều lên môi trường PDA (Potato Dextrose Agar), ủ ở 30oC trong 72 giờ. Khuẩn lạc nấm mốc sẽ được xác định bằng cách đếm số khuẩn lạc/g mẫu tươi. Sau đó phân lập và nuôi cấy các khuẩn lạc này trên môi trường thạch nghiêng PDA [14].
3.2 Nghiên cứu về nấm mốc, nấm men trong quá trình lên men rƣợu nếp than
3.2.1 Giới thiệu
Rượu nếp than là một sản phẩm truyền thống ở Việt Nam, đặc biệt là của người dân nam bộ. Tuy thức uống này chưa được hưởng lợi nhiều từ các nghiên cứu khoa học nhưng nó vẫn thu hút nhiều người với mùi thơm và vị ngọt, màu sắc nâu đỏ hấp dẫn. Sản xuất rượu nếp than là nguồn thu nhập chính của nhiều hộ nông dân. Rượu nếp than được sản xuất trong điều kiện không vô trùng, chủ yếu theo phương pháp thủ công nên sản lượng thấp và chất lượng không ổn định. Theo người sản xuất rượu thì việc chọn lựa bánh men quyết định sản lượng và chất lượng của rượu. Những kiến thức về cách chuẩn bị bánh men và hỗn hợp vi sinh vật cũng như hoạt động của chúng như là nhân tố khởi động còn rất hạn chế.
40
Loài vi sinh vật chủ yếu trong quá trình lên men rượu là Saccharomyces, đặc biệt là Saccharomyces cerevisiae (Battcock và Ali, 1993). Rượu là sản phẩm chính của quá trình lên men nhưng khi nồng độ rượu tăng sẽ ức chế nấm men theo nhiều cách (Jones, 1989; D’Amore và cộng sự, 1990) như sự tăng sinh khối, khả năng sống và lên men. Do đó, khả năng chịu ethanol là một chỉ tiêu quan trọng của nấm men rượu. Phương pháp thí nghiệm là xác định khả năng chịu ethanol bằng cách khảo sát tác động của sự tích tụ ethanol lên sự tăng trưởng theo mẻ, khả năng lên men và khả năng sống của tế bào nấm men và lượng ethanol nhiều nhất tạo thành.
Nghiên cứu này do Nguyễn Thị Phương Dung, F.M. Rombouts, M.J.R. Nout thực hiện năm 2005. Nghiên cứu chỉ ra vai trò của nấm mốc trong việc phân cắt tinh bột thành đường, sự chuyển hóa đường thành ethanol, một số loại bánh men truyền thống được lựa chọn để phân tích và tối ưu hóa trong từng giai đoạn của quá trình lên men. Các loài nấm mốc trong mẫu bánh men được xác định là
Amylomyces rouxii, Amylomyces aff. rouxii, Rhizopus oligosporus và Rhizopus
oryzae có vai trò phân cắt tinh bột thành đường do có enzyme glucoamylase hoạt
động trong quá trình đường hóa tinh bột. A. rouxii có thể tạo 2.5%w/w glucose. Năm dòng nấm men Saccharomyces cerevisiae tạo nồng độ rượu cao nhất được tuyển chọn cho quá trình rượu hóa. Sau đó cho lên men ở nồng độ glucose ban đầu 20% tạo ra 8.8% ethanol. Chúng có khả năng chịu nồng độ rượu cao 9-10% trong điều kiện bình thường và 13.4% (w/v) trong điều kiện lên men fed-batch. Quá trình lên men rượu diễn ra ở 28.3oC trong 4 ngày, dịch đường hóa của gạo được ủ với 5.5 log cfu/ml.
Giống vi sinh vật
53 loài nấm mốc chia làm 3 nhóm (Amylomyces rouxii số 6.9, 20.3, 20.7;
Amylomyces aff. rouxii số 20.2; Rhizopus oryzae số 15.2, 15.4, 15.5), 51 loài nấm
men được phân lập từ 6 loại men truyền thống của Việt Nam. Các men này được lựa chọn từ bộ sưu tập 29 loại men truyền thống đạt những tiêu chuẩn như: có khả năng dịch hóa gạo nấu chín, tạo ra lượng cồn cao, cho mùi hương và màu sắc hấp dẫn. Nấm men được nuôi cấy ở 30oC trong 2 ngày trên môi trường thạch chứa dịch chiết malt (Malt Extract Agar-MEA, Oxoid, CM59). Giống được giữ ở 4o
C.
Từ 51 dòng nấm men này, Saccharomyces cerevisiae là dòng tốt nhất , 5 nòi được lấy ra làm thí nghiệm có đánh số 2.1, 15.7, 20.4, 23.9, 29.2. Nòi Amylomyces
rouxii số 20.3 cũng đươc sử dụng.
Chuẩn bị cấy
Cho 5ml dung dịch muối vô trùng (0.85% w/v NaCl) vào mỗi môi trường thạch nghiêng , dùng vòng cấy làm vụn agar để tạo thành hỗn dịch chứa tế bào nấm men đang phát triển hoặc bào tử nấm mốc.
41
Cho 50g nếp than và 60ml nước cất vào erlen 250ml đậy nút bông, ngâm trong 4 giờ ở 22o
C. Sau khi ngâm, hấp hỗn hợp trong autoclave, 1 giờ, 100oC. Hỗn hợp đã hấp tiếp tục được nấu 35-40oC, sau đó cấy A. rouxii (nòi 20.3) với mật độ 5 log cfu/g gạo và trộn đều. Sau khi ủ 3 ngày ở 30oC, ly tâm khối đường hóa và thu phần dịch. Chuẩn hóa dịch đường thành 20o
Brix bằng cách cho thêm nước vô trùng, sử dụng dụng cụ đo chiết xuất (FG102/112, Euromex-Holland).
Khảo sát quá trình lên men rượu và đánh giá mức độ lên men Vô khuẩn 50 ml dịch đường hóa của nếp than 20o
Brix trong erlen 250ml, đậy nút bông ở 115o
C trong 10 phút. Sau đó dịch này được cấy 106 tế bào nấm men/ml dịch và trộn đều. Ủ dung dịch này ở 30oC trong 5 ngày, sử dụng van khóa (water lock) ở trên để tránh tạp nhiễm trong quá trình thí nghiệm. Cuối quá trình lên men, đo giá trị pH và glucose còn dư.
Mức độ lên men được xác định bởi lượng khí trao đổi từ van Water Lock, sự tiêu thụ glucose và rượu tạo thành trong mẫu được đo mỗi lần cách nhau 6 giờ trong suốt quá trình lên men.
Khảo sát sự tích tụ ethanol trong điều kiện lên men theo mẻ
Khả năng lên men rượu của nấm men trong điều kiện lên men fed-batch có bổ sung glucose từng đợt cũng được thử nghiệm. Khi mức độ khí sinh ra giảm đi, bổ sung 5ml dung dịch glucose 50% w/v vô trùng (đã qua phễu lọc vô trùng) vào 50ml dịch đường hóa đang lên men. Sự bổ sung chỉ dừng lại khi nấm men không sinh khí nữa.
Để xác định mức độ glucose và ethanol, lấy nhanh 0.2ml mẫu và vô khuẩn sau khi cấy giống, ngay trước khi bổ sung đường và sau 15 ngày, lặp lại cách nhau 5 ngày trong 1 tháng lên men. Do môi trường tăng thể tích nên tất cả phân tích (glucose cung cấp, glucose còn và ethanol tạo thành) được thể hiện trên một lượng bằng nhau (g). Lượng khí sinh ra được ghi nhận mỗi ngày.
Khảo sát khả năng chịu ethanol
Cồn tinh khiết được cho vào dịch đường hóa ở nồng độ 0%, 5%,10%, 15% và 20% w/v và hỗn hợp dung dịch này được cấy 104
tế bào nấm men/ml (phương pháp đếm dưới kính hiển vi). Đếm số lượng nấm men sống lúc bắt đầu và sau 3 ngày lên men ở 30oC (phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường MEA).
Phương pháp phân tích
pH được đo bằng thiết bị đo pH kỹ thuật số WTW pH 525. Glucose và ethanol được xác định bằng phương pháp HPLC (BIO-RAD, USA).
42
Kết quả thí nghiệm được phân tích thống kê bằng phần mền Stargraphics Plus Version 5, Manugistics Inc., Rockville, USA và General Algebraic Modeling System (GAMS), Wasington DC, USA.
Khảo sát khả năng lên men
Thiết kế mô hình toán gồm: mức độ cấy giống (4,5,6 log cfu/ml dịch đường hóa), thời gian ủ (2,3 và 4 ngày) và nhiệt độ ủ (20, 30 và 40oC). Mỗi thí nghiệm lặp lại 2 lần.
3.2.2 Kết quả và thảo luận
Khảo sát sự đường hóa tinh bột của nấm mốc
Nấm mốc được rắc lên cơm gạo nếp để nguội trên đĩa, ủ ở 30oC trong 48 giờ, sau đó bổ sung dung dịch idod 0.25%. Kết quả như sau:
Bảng 3.1 Khả năng phân cắt tinh bột của một số loài nấm mốc [15]
Nhóm Số lƣợng (loài) Đƣờng kính vòng trong (cm)
Nhóm 1 8 7.1-9.0
Nhóm 2 21 5.0-9.3
Nhóm 3 24 2.1-4.7
Khảo sát quá trình lên men rượu và đánh giá mức độ lên men
Sau 4 ngày lên men, nhóm 3 thể hiện khả năng lên men rượu cao hơn 2 nhóm còn lại, nồng độ rượu 8.2-8.8 %w/v, lượng glucose thừa là 0, pH = 3.7-3.9, mùi vị cồn mạnh, mùi trái cây nhẹ. 5 dòng lựa chọn ngẫu nhiên từ nhóm 3 đều là
Saccharomyces cerevisiae (số 2.1, 15.7, 20.4, 23.9, 29.2) cho thấy dòng này lên
men rượu tốt. Khả năng lên men của một số loài nấm men được cho trong bảng 3.2.
43 Khảo sát dòng S. cerevisiae No 2.1
- Khí tăng mạnh sau 24 giờ lên men và sau 60 giờ lên men, khí giảm mạnh. - Glucose giảm dần tỉ lệ nghịch với sự tăng nồng độ rượu.
Hình 3.1 Đồ thị sự chuyển hóa glucose, ethanol và khí sinh ra bởi S. cerevisiae
No 2.1 ở 30oC [15]
Khảo sát sự tích tụ ethanol trong điều kiện lên men theo mẻ
Nồng độ ethanol và cơ chất (đường) tương tác lẫn nhau quyết định khả năng ức chế của ethanol lên nấm men. Nồng độ rượu tăng, khả năng sống và lên men của nấm men giảm vì những yếu tố khác nhau làm gia tăng nồng độ rượu bên trong tế bào gây độc cho chính tế bào. Lên men fed-batch giúp duy trì sự sống tế bào, lên men rượu hiệu suất cao và giữ áp suất thẩm thấu càng thấp càng tốt.
Glucose bổ sung vào các ngày 2, 4, 6, 9 và 11, tất cả 5 lần. Quan sát biểu hiện của 5 dòng gần giống nhau.
Sau ngày 11, thêm glucose không làm mới hoạt động lên men lên men nữa nên người ta ngừng thêm glucose sau ngày 11. Quan sát sự thay đổi lượng khí sinh ra cho đến ngày 15.
Lần cuối là sau 11 ngày lên men, quan sát không thấy có sự sinh khí nữa thì cá nhà khoa học giả thiết rằng lúc này mức độ lên men rượu phụ thuộc vào yếu tố khác, như là nồng độ rượu tích lũy cao.
Làm thí nghiệm với 50ml dịch đường 20oBrix chứa 10.5g glucose ban đầu. Mẫu lấy ngày 0, 4, 6, 9, 11, 14, 19, 24 và 29. Ngừng thêm glucose, vẫn phân tích lượng ethanol và glucose cho đủ 1 tháng thì thấy 5 dòng biểu hiện giống nhau.
t (giờ) Gluco se và et han ol Khí
44
Hình 3.2 Đồ thị tỉ lệ sinh khí của 5 giống nấm men S.cerevisiae (No 2.1, 15.7,
20.4, 29.2) trong lên men fed-batch [15]
Hiệu suất tạo ethanol (ethanol yield-EY): khả năng tiêu thụ glucose tạo ra rượu, được tính: EY = (mol ethanol tạo ra/ mol glucose tiêu thụ) x 50%
Theo phương trình phản ứng: C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2. Hiệu suất tạo ethanol cao trong 11 ngày đầu làm nồng độ rượu trong môi trường tăng. Sau 14 ngày so sánh với 11 ngày, lượng glucose tiêu thụ tăng, nồng độ rượu không đổi. Sau 19 ngày, nồng độ rượu tăng và giữ cho đến cuối TN. Ethanol yield (EY) thay đổi từ 84-98% .
Lần thêm glucose cuối cùng không ảnh hưởng đến quá trình lên men ngay mà sau đó 1 tuần, thời gian cần thiết để phục hồi khả năng lên men. EY giảm nhẹ từ đó cho đến cuối TN.
Bổ sung glucose: 5ml/lần x 5, thể tích tăng từ 50ml lên 75ml. Lượng ethanol max = 10.1g (13.4% w/v), glucose còn lại ít (=2.3g) nên các nhà khoa học dự tính 13.4% w/v là khả năng chịu ethanol trong điều kiện lên men này.
t (ngày)
45
Hình 3.3 Đồ thị hiệu suất tạo ethanol của 5 giống nấm men S.cerevisiae (No
2.1, 15.7, 20.4, 29.2) trong lên men fed-batch [15] Thử khả năng chịu ethanol
Xác định số tế bào sống ban đầu và sau 3 ngày lên men ở 30oC bằng phương pháp đếm khuẩn lạc, log cfu/mL.
So sánh với mội trường nuôi cấy bình thường , ta thấy : - Ở 0% hoặc 5% ethanol: lượng tế bào sống cao hơn. - Ở 10%-20%: lượng tế bào sống giảm.
khả năng chịu ethanol 9-10%.
Hình 3.4 Đồ thị phát triển và suy vong của 5 giống nấm men S.cerevisiae (No
2.1, 15.7, 20.4, 29.2) theo nồng độ rượu khác nhau [15]
Hiệu suấ t tạ o etha no l (% ) Mậ t đ ộ tế bào nấ m m en ( cfu.ml -1 )
46
Kết quả này thấp hơn môi trường lên men fed-batch, do khác nhau về sự thay đổi dần dần (fed-batch) và thay đổi tức thời trong thí nghiệm này. Môi trường fed- batch tạo điều kiện huấn luyện thích nghi cho giống vi sinh vật tốt hơn.
Tác động của mật độ nuôi cấy và điều kiện ủ lên sự tạo ethanol của S. cerevisiae
Thí nghiệm được thực hiện trên loài 2.1. Ở 30oC, lên men 4 ngày, lượng glucose được tiêu thụ nhiều nhất, nồng độ rượu sinh ra cao nhất, pH = 3.7-3.9 không do sự tạp nhiễm mà do sự hình thành một số acid đồng thời với quá trình chuyển hóa tạo rượu. Nếu tăng mật độ cấy, sự lên men diễn ra nhanh hơn.
Ở 20o
C và 40oC, sự lên men chậm hơn thông qua lượng glucose tiêu thu và lượng rượu tạo ra. Ở 20oC, tăng mật độ cấy, tăng tiêu thụ glucose còn 40o
C thì ngược lại sự phụ thuộc của tốc độ tăng trưởng vào nhiệt độ và chịu stress bởi ethanol khác nhau ở những nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ tối thích.
Điều kiện tối ưu cho quá trình lên men rượu là: Topt = 28.3oC, thời gian 4 ngày, mật độ cấy 5.5 log cfu/ml, nồng độ rượu 9%. Sự thống kê tác động của nhiệt độ và thời gian lên quá trình tạo rượu đạt độ tin cậy là 95% nên chấp nhận kết quả.
Như vậy, năm dòng Saccharomyces cerevisiae tạo nồng độ rượu cao nhất được chọn. Cho lên men ở nồng độ glucose ban đầu 20% tạo ra 8.8% ethanol. Chúng có khả năng chịu nồng độ rượu cao 9-10% trong điều kiện bình thường và 13.4% (w/v) trong điều kiện lên men fed-batch. Quá trình lên men rượu diễn ra ở 28.3o
C trong 4 ngày, dịch đường hóa của gạo được ủ với mật độ tế bào là 5.5 log cfu/ml [15].
3.3 Nghiên cứu tình hình tiêu thụ rƣợu ở một số nƣớc trên thế giới và Việt Nam
Nghiên cứu này được thực hiện bởi Phạm Xuân Đà - Cục vệ sinh và an toàn thực phẩm - để nhằm có cơ sở khoa học tham khảo cho đề tài nghiên cứu thực trạng và đề xuất các biện pháp quản lý an toàn thực phẩm đối với rượu truyền thống tại Việt Nam. Sử dụng phương pháp nghiên cứu hồi cứu có phân tích. Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê. Qua nghiên cứu mức độ tiêu thụ đồ uống của một số nước, cho kết quả: mức độ tiêu thụ đồ uống có cồn ở một số nước đều có xu hướng tăng theo các năm và mức độ tiêu thụ của Việt Nam ở những năm 2000 còn thấp hơn các nước trong khu vực, chỉ cao hơn Campuchia, Indonexia và Myanma.
Theo nghiên cứu, tổng sản lượng rượu trên thế giới năm 1998 là 32290 triệu lít, năm 2001 là 38050 triệu lít. Trong đó, rượu vang: chỉ tính 28 nước có sản xuất rượu vang lớn, năm 1998 là 25 tỷ lít nhưng qua năm 2001 là 29 tỷ lít. Rượu mạnh: các nước có sản lượng rượu mạnh đứng đầu thế giới là Hoa Kỳ, năm 1986 sản lượng đạt 1475 triệu lít, Nga năm 1992 đạt 1366 triệu lít, vương quốc Anh năm 1990 là 1287 triệu lít,
47
Nhật Bản năm 1992 đạt 613,5 triệu lít. Mức độ tiêu thụ thức uống có cồn ở một số nước được cho trong bảng 3.3 [12].
Bảng 3.2 Khả năng lên men của một số loài nấm men [15]
Nhóm (số loài) Lƣợng ethanol tạo
thành (%w/v) Lƣợng glucose còn lại