Công thức tính hệ số nhân giống theo George (1993)
K= (N/N0)T/t
Trong đó: K: Số chồi
N0: Số chồi ban đầu
N: Số chồi thu được sau một lần cấy T: Thời gian cần để thực hiện (tuần) t: Thời gian giữa 2 lần cấy chuyền
Từ kết quả thí nghiệm trên, nếu chọn nghiệm thức 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA (có số chồi trung bình 3,78 chồi) để tiến hành nhân giống. Như vậy, nếu áp dụng công thức tính hệ số nhân chồi của George (1993), về mặt lý thuyết chúng ta có thể tạo ra được trên 104.300 chồi/năm từ một chồi ban đầu.
Tóm lại, để có thể tạo ra một số lượng lớn chồi hữu hiệu phục vụ cho nhu cầu sản xuất, việc sử dụng kết hợp giữa cytokinin và auxin ở tỷ lệ 10/1 tỏ ra có ưu điểm hơn so với việc chỉ sử dụng cytokinin trong việc tạo chồi cây gấc trong điều kiện in vitro. Trong đó nghiệm thức 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA có hiệu quả tạo chồi cao hơn so với các nghiệm thức còn lại.
Tuy nhiên, kết quả thí nghiệm này có sự khác biệt đối với kết quả thí nghiệm tạo chồi gấc in vitro của Trang Ngọc Diệp (2005), với số chồi đạt cao nhất ở nghiệm thức 0,6 ppm BA (3,43 chồi) vào thời điểm 6 TSKC. Ngược lại, ở thí nghiệm này nghiệm thức 0,6 ppm BA chỉ tạo được 0,6 chồi hữu hiệu vào thời điểm 6 TSKC. Điều này có thể do mẫu chồi cấy chuyền nhiều lần trên môi trường cơ bản MS có bổ sung BA, nên nồng độ cytokinin tích tụ dần trong mẫu chồi cấy, từ đó làm cho chồi trở nên sinh trưởng và phát triển kém với lá xanh vàng, tạo callus to, tạo ít chồi hữu hiệu. Vì vậy, để đạt hệ số nhân chồi cao có thể nên sử dụng những mẫu chồi gấc khi mới đưa vào khử trùng tạo chồi, hoặc cấy chuyền mẫu chồi trên môi trường cơ bản MS không có bổ sung hoặc bổ sung chất ĐHST với nồng độ thấp. Như thế khi tiến hành tạo chồi sẽ cho hiệu quả cao hơn.
Hình 3.1 Sự sinh trưởng của chồi gấc in vitroở các nghiệm thức có nồng độ BA khác nhau vào thời điểm 6 tuần sau khi cấy
0,1 ppm BA (6 TSKC) 0,2 ppm BA (6 TSKC) 0,4 ppm BA (6 TSKC) 0,6 ppm BA (6 TSKC) 0,8 ppm BA (6 TSKC)
Hình 3.2 Sự sinh trưởng của chồi gấc in vitroở các nghiệm thức có nồng độ BA và IBA khác nhau vào thời điểm 6 tuần sau khi cấy
0,8 ppm BA+0,08 ppm IBA (6TSKC) 0,4 ppm BA+0,04 ppm IBA (6TSKC) Đối chứng (6 TSKC) 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA (6TSKC) 0,1 ppm BA+0,01 ppm IBA (6TSKC)
3.2 Thí nghiệm 2: Hiệu quả của Naphthaleneacetic acid(NAA) và than hoạt tính trên sự tạo rễ chồi gấc in vitro tính trên sự tạo rễ chồi gấc in vitro
Trong quá trình vi nhân giống, sự tạo rễ bất định phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: độ tuổi và giai đoạn phát triển của cây, vị trí thu mẫu trên cây, loài thực vật, ánh sáng, nhiệt độ, đường, nguồn dinh dưỡng khoáng và các chất điều hoà sinh trưởng thực vật. Đặc biệt là auxin, vì hầu hết thực vật cần phải có auxin để cảm ứng ra rễ. Nhưng loại và nồng độ auxin phụ thuộc vào nhiều loài thực vật. Trong đó, IBA và NAA là 2 loại auxin có hiệu quả nhất trong sự kích thích ra rễ. Thêm vào đó than hoạt tính cũng được biết đến như là yếu tố quan trọng góp phần tạo rễ tốt hơn cho nhiều loài thực vật (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002). Do đó, thí nghiệm này nhằm tìm ra loại và nồng độ auxin thích hợp cũng như sự hiện diện của than hoạt tính trong sự tạo rễ chồi gấc in vitro.
3.2.1 Trọng lượng cụm chồi gia tăng (g)
Kết quả trình bày ở Bảng 3.5 cho thấy, vào thời điểm 5 TSKC ở tất cả các nghiệm thức có sử dụng NAA đều có sự gia tăng trọng lượng cao hơn so với nghiệm thức đối chứng (không sử dụng NAA). Trong đó nghiệm thức 0,2 ppm NAA có trọng lượng cụm chồi gia tăng cao nhất (0,4 g), có khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% so với nghiệm thức đối chứng có trọng lượng gia tăng thấp nhất (0,23 g). Tuy nhiên giữa chúng lại không có sự khác biệt.
Khi kểđến nhân tố than hoạt tính trong việc gia tăng trọng lượng mẫu chồi gấc sau thời gian nuôi cấy, ở các nghiệm thức không sử dụng than hoạt tính, trọng lượng gia tăng không đáng kể. Trong đó, nghiệm thức 0,4 ppm NAA có trọng lượng gia tăng cao nhất (0,27 g), có khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% so với nghiệm thức đối chứng (không sử dụng NAA) có trọng lượng cụm chồi gia tăng thấp nhất (0,14 g). Tuy nhiên lại không có khác biệt so với các nghiệm thức còn lại.
Kết quả trình bày ở Bảng 3.5 cũng cho thấy, có sự tương tác giữa nồng độ NAA và than hoạt tính. Các nghiệm thức có sự kết hợp giữa than hoạt tính và nồng độ NAA có trọng lượng cụm chồi gia tăng cao hơn so với các nghiệm thức không sử dụng than hoạt tính. Trong đó, nghiệm thức 0,2 ppm NAA có trọng lượng gia tăng cao nhất (0,59 g) và có khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% so với các
nghiệm thức còn lại. Nghiệm thức đối chứng có trọng lượng cụm chồi gia tăng thấp nhất (0,32 g).
Bảng 3.5 Hiệu quả của NAA và than hoạt tính trong sự gia tăng trọng lượng cụm chồi gấc in vitro vào thời điểm 5 tuần sai khi cấy
Nghiệm thức Than hoạt tính (g/l) 0 2 Trung bình Đối chứng 0,1 ppm NAA 0,2 ppm NAA 0,4 ppm NAA 0,6 ppm NAA 0,8 ppm NAA 0,14 b 0,23 ab 0,21 ab 0,27 a 0,22 ab 0,19 ab 0,32 c 0,38 bc 0,59 a 0,46 b 0,45 b 0,58 a 0,23 c 0,30 b 0,40 a 0,37 ab 0,34 ab 0,39 a Trung bình 0,21b 0,46 a F (A) F (B) F (A x B) CV (%) ** ** ** 27,67 Ghi chú :
Trong cùng một cột các số có chữ số theo sau giống nhau không khác biệt có ý nghĩa thống kê.
ns: không khác biệt có ý nghĩa thống kê
*: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%
**: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1%
F(A): Than hoạt tính
F(B): nồng độ NAA
F(A x B): Tương tác giữa than hoạt tính và NAA
Trong suốt quá trình tiến hành thí nghiệm ghi nhận, ở nghiệm thức 0,8 ppm NAA có sự hình thành khối mô sẹo to nhất, có màu nâu vàng và xốp sau 5 tuần nuôi cấy. Điều này có thể do nồng độ NAA quá cao đã kích thích sự tạo mô sẹo. Trọng lượng tươi gia tăng bao gồm sự gia tăng về số lượng, chiều cao, số lá và khối mô sẹo hình thành ở phần gốc của mẫu chồi cấy. Kích thước khối mô sẹo gia tăng khi nồng độ chất điều hoà sinh trưởng gia tăng. Theo Nguyễn Đức Lượng và ctv. (2002), ở những loài cây thân gỗ cần có auxin mạnh với nồng độ cao hơn cây thân
thảo để ra rễ. Ngược lại cây thân thảo thường sử dụng loại auxin có tác dụng yếu như IAA trong suốt quá trình tạo rễ. Do đó, nếu sử dụng những loại auxin mạnh như NAA và 2,4-D với nồng độ cao thì có thể có sự tạo mô sẹo từ mẫu cấy. Mô sẹo sau khi hình thành nếu tiếp tục duy trì trong môi trường có auxin thì mô sẹo tăng sinh nhanh và tuỳ thuộc vào thành phần cũng như nồng độ auxin sử dụng (Bonner và Galston, 1959; De Garcia và Martinez, 1995; Grant và Fuller, 1968), nồng độ auxin cao kích thích tạo mô sẹo dạng bở, nồng độ thấp mô sẹo dạng nốt và chắc (Ceriani và ctv, 1992) (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002). Mô sẹo thường tăng trưởng trong môi trường đặc. Thêm vào đó, những mảnh cơ quan đã trưởng thành thì không có khả năng tạo sẹo, ngược lại cây non cắt đoạn có thể tạo mô sẹo trên môi trường có chất điều hoà sinh trưởng thực vật, đặc biệt là auxin. Như vậy, có thể mẫu chồi gấc đã được cấy chuyền nhiều lần trước khi bố trí thí nghiệm nên trở nên trẻ hoá, từđó rất dễ tạo mô sẹo.