Một trong những yếu tố quan trọng trong sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và mô thực vật là thành phần môi trường nuôi cấy. Thành phần môi trường nuôi cấy của tế bào và mô thực vật thay đổi tuỳ theo loài, theo bộ phận nuôi cấy và theo giai đoạn phân hoá của mẫu cấy và mục đích thí nghiệm. Tất cả môi trường nuôi cấy đều bao gồm 5 thành phần:
- Khoáng đa lượng - Khoáng vi lượng - Vitamin
- Đường và nguồn cung cấp carbon - Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật
Nguyên tố khoáng đa lượng
Khoáng đa lượng rất cần cho cây và ảnh hưởng đến sự hấp thu dinh dưỡng của mô cấy và chúng không gây độc. Các nguyên tố khoáng thường sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm. Các nguyên tố này bao gồm Nitrogen (N), Phosphorus (P), Potassium (K), Calcium (Ca), Magnesium (Mg),…
+ Nguồn nitơ: thường được sử dụng dưới dạng (NO3-) và ammonium (NH-
4+), đồng thời cũng sử dụng dưới dạng hữu cơ như amino acid. Việc sử dụng đồng thời nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ ở hàm lượng thích hợp sẽ thúc đẩy tế bào sinh trưởng mạnh hơn so với việc chỉ dùng amino acid làm nguồn nitơ (Vũ Văn Vụ và ctv., 1998) (trích dẫn bởi Đỗ Thị Trang Nhã, 2005).
+ Potassium: (K+) là một cation chủ yếu trong cây, giúp cây cân bằng các anino vô cơ và hữu cơ. K+ có vai trò điều hoà pH và áp suất thẩm thấu của môi trường nội bào (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002). Sự thiếu K+ trong môi trường nuôi cấy sẽ gây nên tình trạng thừa nước và làm giảm tốc độ hấp thu phosphate (Miller và ctv., 1996) (trích dẫn bởi Đỗ Thị Trang Nhã, 2005). Tuy nhiên, sự chênh lệch về nồng độ K+ trong môi trường nuôi cấy chỉ ảnh hưởng rất nhỏ trên sự tăng trưởng hoặc tăng sinh của chồi cây Lê (Loreti và ctv., 1988) (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002).
+ Phosphorus (P): là nguyên tố tham gia vào vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, nucleic acid và tham gia vào cấu trúc của màng. Nồng độ phosphorus hoà tan cao trong môi trường sẽ làm giảm sự tăng trưởng của mô. Nồng độ ion phosphate được đưa vào môi rường nuôi cấy cao nhất là 18,9 mM, trung bình 1,7 mM và hầu hết các loại môi trường đều chứa phosphate khoảng 1,3 mM. Mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu về phospho rất cao vì nó là thành phần cấu trúc của phân tử nucleic acid. Phospho ở dạng H2PO4- và HPO42- có tác dụng như một hệ thống đệm làm ổn định pH của môi trường trong suốt quá trình nuôi cấy (Lê Trần Bình và ctv., 1997).
+ Calcium (Ca2+): có vai trò trong sự phát sinh hình thái, đồng thời cảm ứng các chất điều hoà sinh trưởng đặc biệt là cytokinin và auxin. Trên khúc cắt thân torenia sự tạo chồi bất định được cảm ứng bởi cytokinin bị ảnh hưởng do sự gia tăng hàm lượng Ca2+ nội bào (Tanimoto và Harada, 1986) (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002).
+ Sắt (Fe): là yếu tố cần thiết cho sự chuyển hoá, khi thiếu sắt thì các tế bào sẽ mất khả năng phân chia, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây. Sự hiện diện của nguyên tố sắt đặc biệt quan trọng cho quá trình tạo chồi và rễ bất định (Legrand, 1975) (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002). Sắt thường sử dụng ở dạng phức chelate (Fe-EDTA) với nồng độ 10-30 mg/l, ở dạng này sắt không bị kết tủa mà phóng thích từ từ vào môi trường nuôi cấy theo nhu cầu của mô thực vật (Nguyễn Văn Uyển, 1993) (trích dẫn bởi Đỗ Thị Trang Nhã, 2005).
Những nguyên tố vi lượng thường được sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30 ppm. Các nguyên tố khoáng đa lượng có thể ảnh hưởng đến sự phân hoá tế bào khi kết hợp với các chất điều hoà sinh trưởng thực vật (Beasley và ctv., 1974). Sự thiếu ion Mn2+ làm giảm sự khởi tạo chồi trên mẫu cấy tử diệp Xà lách (Doerschug và Miller, 1976). Welander (1977) (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002), đã đưa ra những bằng chứng cho thấy rằng tế bào thực vật trong quá trình phát sinh hình thái sẽ cần nhiều khoáng vi lượng hơn.
Nguồn carbon và năng lượng
Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng, mặc dù ở nhiều trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng nhờđiều kiện ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp. Vì vậy việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn carbon hữu cơ là điều bắt buộc (Lê Trần Bình và ctv., 1997). Nhưng hàm lượng đường quá cao sẽ hạn chế hiệu quả hấp thu nước của mô cây. Đường cần thiết cho sự ra rễ ở nhiều loài thực vật, Gautheret chứng minh rằng glucose là nguồn carbohydrate giúp cho sự ra rễ của chồi in vitro thích hợp hơn là fructose và sucrose (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002). Glucose và sucrose được sử dụng nhiều trong in vitro nhưng trong đó sucrose được sử dụng phổ biến hơn (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002). Trên cây Cucumis hystrix (Michael và ctv., 2001), cây dâu tây (Hyung, 1996), và cây hàng (Teruyuki, 1999) cho thấy hàm lượng đường 30 g/l thích hợp cho chồi phát triển tốt. Tuy nhiên, theo Rier và ctv. (1987), đường giúp cho mô cấy tăng trưởng nhưng đồng thời ức chế sự tổng hợp diệp lục tố (trích dẫn bởi Đỗ Thị Trang Nhã, 2005).
Nước dừa
Bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng sự sinh trưởng và phát triển của mô. Theo Tulecke và ctv. (1961) (trích dẫn bởi Nguyễn Minh Hùng, 2006) trong nước dừa có hàm lượng amino acid tự do đạt nồng độ từ 190,5-685 ppm trong nước dừa tuỳ theo tuổi của quá trình từ non đến già. Khi hấp ở nhiệt độ cao chỉ còn 70 ppm. Ngoài ra, nước dừa còn chứa các hoạt chất có hoạt tính như auxin, các cytokinin dạng glycoside có lợi cho sự tạo mô sẹo, tạo chồi, tạo rễ và tái sinh cây (Nguyễn Đức Thành, 2000) (trích dẫn bởi Đỗ Thị Trang Nhã, 2005). Trong nuôi cấy mô, nước dừa thường được sử dụng với lượng 10-20% thể tích môi trường (Nguyễn Văn Uyển, 1993) (trích dẫn bởi Đỗ Thị Trang Nhã, 2005).
Thạch (Agar)
Được sử dụng để làm cứng môi trường, để làm giá đỡ cho môi trường nuôi cấy tế bào thực vật. Tuỳ theo đối tượng mà hàm lượng thạch được đưa vào biến động từ 0,8-1,5%, có thể tăng đến 1,6% (Nguyễn Bảo Toàn, 2005). Nồng độ thạch cao trong môi trường nuôi cấy sẽ hạn chếđược hiện tượng cây bị thuỷ tinh thể, thuỷ
tinh thể là hiện tượng các cơ quan nuôi cấy bị mọng nước, trong suốt, chồi biến dạng và hơi vàng, những chồi này sẽ không có sức sống khi đưa ra vườn ươm (Nguyễn Quốc Thiện, 2003) (trích dẫn bởi Đỗ Thị Trang Nhã, 2005). Theo Debergh (1981) (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002), khi sử dụng nồng độ thạch 1,1-2% trong môi trường nuôi cấy cây artichoke thì sẽ hạn chế gần như hoàn toàn hiện tượng này. Bên cạnh đó, nếu cấy trong môi trường quá đặc thì rễ khi hình thành sẽ mọc hướng lên trên không khí (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002). Thêm vào đó, khi cấy chồi trên môi trường agar thì lông rễ sẽ không phát triển bình thường vì trong môi trường agar điều kiện thông khí kém, thiếu O2. Lông hút xuất hiện nhiều trên rễ khi rễ hình thành trong môi trường lỏng và càng nhiều lông hút được hình thành khi chồi được cắm trên một cầu giấy trong môi trường lỏng (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002).
Vitamin
Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có khả năng tự tổng hợp được hầu hết các loại vitamin, nhưng thường không đủ về lượng, do đó cần phải bổ sung từ bên ngoài vào, đặc biệt là các vitamin thuộc nhóm B (Lê Trần Bình và ctv., 1997). Các vitamin thường được sử dụng là thiamin (B1), nicotinic acid (B3), pyridoxine (B6) và myo-inositol. Trong đó, thiamin được xem là loại vitamin thiết yếu cho hầu hết các loại cây trồng trong nuôi cấy mô (Gamborg và ctv., 1976), thường được dùng ở nồng độ 0,1-10 mg/l (Bùi Bá Bổng, 1995) (trích dẫn bởi Nguyễn Minh Hùng, 2006).
Than hoạt tính
Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy thường được tiến hành khi cảm ứng ra rễ. Than có tác dụng làm đen môi trường, khử độc môi trường bằng cách kết hợp với các hợp chất phenol độc do mô cây tiết ra trong suốt thời gian nuôi cấy, hút các chất điều hoà sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy. Than tính than có vai trò quan trọng trong sự tạo rễ bất định. Tuy nhiên, nó có thể làm thay đổi pH của môi trường (Nguyễn Văn Uyển, 1984) (trích dẫn bởi Nguyễn Minh Hùng, 2006).
Chất điều hoà sinh trưởng thực vật
Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật, thành phần quan trọng nhất quyết định đến kết quả nuôi cấy là chất điều hoà sinh trưởng thực vật. Có thể là các chất nội sinh hay ngoại sinh dù với một lượng nhỏ (10-9), nhưng lại là yếu tố điều khiển. Hiệu lực tác dụng của chúng rất khác nhau, tuỳ thuộc vào bản chất, nồng độ và từng loại tế bào. Có 2 nhóm chất điều hoà sinh trưởng thực vật được sử dụng rộng rãi là auxin và cytokinin (Vũ Văn Vụ, 1990), (trích dẫn bởi Đỗ Thị Trang Nhã, 2005).
+ Auxin
Auxin là thuật ngữ chung đại diện cho lớp của những hợp chất được đặc tính hoá bởi khả năng gây ra sự vươn dài trong tế bào chồi trong vùng gần đỉnh. Auxin nói chung mang tính acid với một nhân không bão hoà hoặc những dẫn xuất của chúng (Nguyễn Minh Chơn, 2005).
Ngoài IAA (indole-3-acetic acid) nội sinh do đầu bao lá mầm tự tổng hợp được Went, nhà sinh lý học Hà Lan phát hiện ra đầu tiên vào năm 1926. Sau này người ta còn phát hiện ra cây còn tổng hợp 2 loại chất điều hoà sinh trưởng thực vật có hoạt tính giống IAA là PAA (phenylacetic acid) và 4-chloroIAA (4- chloroindoleacetic acid). Ngoài ra, người ta còn tổng hợp được một số chất có hoạt tính tương tự như auxin là NAA (naphthaleneacetic acid), IBA (indole-3-butyric acid), 2,4-D (2,4-dichlorophenolxyacetic acid), 2,4,5-T (2,4,5- trichlorophenolxyacetic acid), MCBA (2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid) (Salisbury and Ross, 1992) (trích dẫn bởi Đỗ Thị Trang Nhã, 2005).
Auxin được tổng hợp chủ yếu ởđỉnh chồi ngọn, đỉnh thân, lá non, những bộ phận còn non của cây, các mô phân sinh, mầm hoa, hột đang phát triển. Auxin vận chuyển trong cây mang tính phân cực theo hướng từđỉnh chồi ngọn xuống đến rễ. Sự di chuyển mang tính phân cực này thậm chí xảy ra khi chồi bị đảo ngược (Torry, 1981) (trích dẫn bởi Đỗ Thị Trang Nhã, 2005).
Trong nuôi cấy mô, auxin có các vai trò chính gồm: tạo rễ bất định (ở nồng độ cao), tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp), kích thích phôi sinh dưỡng, phân chia tế bào, thành lập mô sẹo và phát triển, ức chế sự phát triển chồi nách, ức chế sự phát triển rễ (Nguyễn Bảo Toàn, 2005). Ngoài ra, auxin còn có tác động quang hướng
động, địa hướng động, sự sản sinh ethylene, sự phát triển của trái, trinh quả sinh, sự rụng và sự thể hiện giới tính (Nguyễn Minh Chơn, 2005).
Ở một số loài thực vật sự cảm ứng ra rễ nhất thiết phải chuyển chồi sang môi trường không có cytokinin, có một số loài có thể ra rễ trực tiếp mà không cần môi trường cảm ứng là aechmea, anh đào, đỗ quyên. Tuy nhiên ở một số loài sự ra rễ nhất thiết phải có sự hiện diện của auxin. Những loại auxin thường được bổ sung vào môi trường tạo rễ là IAA (0,1-10 mg/l), NAA (0,05-1 mg/l), IBA (0,5-3,0 mg/l). Sự đáp ứng của chồi và sự hình thành rễ hoàn toàn phụ thuộc vào loại thực vật (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002). Áp dụng auxin ngoại sinh có thể kích thích sự tượng rễ và sự phát triển sớm của rễ, trái lại sự vươn dài của rễ nói chung bị ức chế trừ khi áp dụng với nồng độ đủ nhỏ (Nguyễn Minh Chơn, 2005). Do đó, trong điều kiện in vitro thường sử dụng auxin với nồng độ cao để cảm ứng sự tạo rẽ (rễ sơ khởi). NAA và IBA thường dùng để cho sự ra rễ và phối hợp với cytokinin, các auxin tổng hợp này cũng được sử dụng để tạo rễ cành giâm các loại cây ăn trái và hoa kiểng phục vụ cho công tác nhân giống (Lê Văn Hoà và ctv., 2001) (trích dẫn bởi Nguyễn Minh Hùng, 2006).
+Cytokinin
Cytokinin được Skoog (1950), phát hiện đầu tiên trong một thí nghiệm chiết xuất nucleic acid bị sơ suất, đó là những cấu tử của nucleic acid bị phân huỷ thành (trích dẫn bởi Lê Trần Bình và ctv., 1997).
Cytokinin là chất điều hoà sinh trưởng thứ ba được phát hiện sau auxin và gibberellins. Trong nuôi cấy mô cytokinin có các tác dụng chính gồm: tạo chồi phụ (ở nồng độ cao), ức chế tạo rễ, phân chia tế bào, thành lập và tăng trưởng mô sẹo, kích thích mọc chồi nách, ức chế sự vươn dài chồi, ức chế sự lão hoá lá (Nguyễn Bảo Toàn, 2005). Cytokinin có khả năng kích thích chồi bên và đặc biệt là vượt qua ảnh hưởng ưu thế chồi ngọn, nhưng khi chồi bên được tạo ra thì cần phải loại bỏ cytokinin ra khỏi môi trường đồng thời bổ sung auxin để chồi có thể tạo rễ (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002). Ưu thế chồi ngọn được điều khiển bởi sự cân bằng giữa mức độ cytokinin và auxin nội sinh. Điều này là do cytokinin có thểức chế enzyme IAA oxidase trong chồi bên cho phép tích luỹ auxin và gây ra sự vươn dài của chồi
bên, có thể cytokinin khởi đầu cho cơ chế liên quan đến sức chứa ở chồi bên bằng cách kích thích sự vận chuyển dinh dưỡng, vitamin, khoáng và những chất sinh trưởng khác để tác động đến sự sinh trưởng (Nguyễn Minh Chơn, 2005).
Cytokinin hiện diện trong tất cả các thực vật khác nhau. Ngoài ra, bằng con đường hoá học người ta đã tổng hợp được một số chất có hoạt tính tương tự cytokinin như BAP (6-benzylamino-9-(-2tetrahydropyranyl)-9H-purine), BA (6- benzylaminopurine), kinetin (6-furfurylaminopurine). Trong nuôi cấy mô BA và kinetin được sử dụng thông dụng nhất.
Khó có thể đoán trước là loại cytokinin nào phù hợp với mẫu cấy. Khi sử dụng cytokinin với nồng độ cao sẽ tạo ra những chồi không bình thường, tốt hơn là nên chuyển các chồi bất định hình thành trên môi trường có nồng độ cytokinin cao sang môi trường có nồng độ cytokinin thấp hơn để chồi tăng trưởng.
Cytokinin ức chế sự hình thành rễ bất định, điều này đã có nhiều tranh luận liên quan đến vai trò của cytokinin, đặc biệt là BA trong sự tạo rễđã được công bố. Sử dụng BA ở nồng độ tối hảo, có thểđưa đến khởi sự tạo rễ, nên cytokinin được sử dụng trong môi trường vươn dài trước giai đoạn ra rễ hoặc giảm nồng độ cytokinin xuống thấp, khi cấy chuyền lần cuối trước khi chuyển chồi vào môi trường tạo rễ.
Theo Nguyễn Minh Chơn (2005), chất điều hoà sinh trưởng có tác dụng kích thích sẽ thể hiện tác động kích thích ở nồng độ thấp và tăng dần đến ảnh hưởng tối đa. Khi nồng độ vượt qua mức kích thích tối đa sẽ gây ra ảnh hưởng ức chế.
Hình 1.1Đường cong diễn tả mức độđáp ứng điển hình đối với nồng độ chất điều hoà sinh trưởng
M ứ c độ đ áp ứ ng
Mối tương quan giữa cytokinin và auxin trong nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Theo Miller và Skoog (1957) (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002), là người đầu tiên nhận thấy tỷ lệ auxin/ cytokinin xác định dạng phân hoá cơ quan của tế bào thực vật nuôi cấy. Khi tỷ lệ cân đối giữa auxin và cytokinin điều khiển sự thành lập rễ, chồi và mô sẹo, sự thành lập chồi nách và rễ bất định. Khi tỷ lệ nồng độ auxin/cytokinin cao thì mô cấy phát triển mạnh theo khuynh hướng hình thành rễ, ngược lại mô cấy phát triển mạnh theo hướng phát sinh nhiều chồi. Do đó trong quá trình tạo chồi người ta sử dụng auxin với nồng độ thấp phối hợp cùng với cytokinin ở nồng độ cao. Tỷ lệ cytokinin/auxin thường là 10/1 (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002).
Mối tương quan này được biểu diễn theo mô hình của Edwin (1993) (theo trích dẫn bởi Nguyễn Bảo Toàn, 2005).
Chiều hướng ra rễ
Hình thành mô sẹo ở cây đơn tử diệp Giai đoạn đầu tạo phôi
Phát sinh chồi từ mô sẹo Hình thành mô sẹo ở cây song tử diệp
Phát sinh chồi bất định Sự tăng nhanh chồi nách
Hình 1.2 Mối tương quan giữa hàm lượng auxin và cytokinin trong nuôi cấy mô Nồng độ auxin thấp Nồng độ cytokinin cao Nồng độ auxin cao Nồng độ cytokinin thấp
CHƯƠNG II
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 PHƯƠNG TIỆN
2.1.1 Thời gian và địa điểm
Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, Bộ môn Sinh Lý-Sinh Hoá, Khoa Nông Nghiệp & SHƯD, trường Đại học Cần Thơ từ tháng 08/2006 đến tháng 02/2007.
2.1.2 Vật liệu
Các mẫu chồi thí nghiệm đã được nuôi cấy tại phòng nuôi cấy mô của Bộ môn Sinh Lý-Sinh Hoá, khoa Nông nghiệp & SHƯD, trường Đại học Cần thơ.
2.1.3 Thiết bị và dụng cụ - Tủ cấy vô trùng - Tủ lạnh đựng hoá chất - Tủ sấy cao độ - Nồi hấp khử trùng