và Kirby, 1997)
Nguyên tắc
Khả năng ức chế của các hợp chất thảo dược được xác định dựa vào đường kính vòng vô khuẩn hình thành do sự khuếch tán các hợp chất xung quanh đĩa giấy tẩm hợp chất. Hiệu quả kháng khuẩn được xác định dựa vào đường kính của các vòng ức chế vi khuẩn.
Cách tiến hành
Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn theo phương pháp Mc Farland.
Ống số 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
BaCl2 1%(ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
H2SO4 1%(ml) 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9,0
Tb/ml(x 108) 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
Chuẩn bị vi khuẩn để thử nghiệm kháng sinh đồ: giống vi khuẩn V. harveyi thuần chủng. Vi khuẩn được cấy tăng sinh trên môi trường BHIA + 2% NaCl, thu tế bào vi khuẩn và huyền phù với nước muối sinh lý 2% vô trùng.
Pha hỗn hợp dịch tế bào của vi khuẩn sao cho dung dịch huyền phù có cùng độ đục với ống số 3 theo Mc Farland.
- Chuẩn bị các đĩa giấy (đường kính = 6mm) trong điều kiện vô
trùng. Hòa tan các hợp chất thảo dược trong dung môi DMSO với các nồng độ dự kiến thử nghiệm tùy vào mức độ tan của các hợp chất trong dung môi. Cụ thể, các nồng độ cho từng hợp chất là:
+ Hợp chất B2: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 và 100 µg/µl. + Hợp chất L: 600, 700, 800, 900, và 1000 µg/µl.
+ Hợp chất L2: 600, 700, 800, 900 và 1000 µg/µl. + Hợp chất M: 200, 300, 400, 500, 600 và 700 µg/µl.
- Dùng pippet hút 5 µl các hợp chất cần thử nghiệm tẩm vào các đĩa giấy.
- Chuẩn bị các đĩa môi trường MHA để thử kháng sinh đồ.
- Dùng pipet hút 0,5 ml dung dịch vi khuẩn cho vào môi trường
MHA trong đĩa petri, dàn đều dịch vi khuẩn lên đĩa thạch. Sau đó dùng pipet hút hết phần dung dịch vi khuẩn thừa trên mặt thạch.
- Dùng kẹp vô khuẩn lấy các đĩa giấy đã tẩm các hợp chất hợp chất
thử nghiệm đặt lên bề mặt thạch, cách mép đĩa petri khoảng 2,5 cm, đảm bảo mặt đĩa giấy tẩm hợp chất tiếp xúc phẳng với bề mặt thạch.
- Ủ các đĩa petri trong tủ ấm ở 300C sau các khoảng thời gian 4 giờ, 8 giờ và 12 giờ kiểm tra và đo vòng vô khuẩn.
Sau giai đoạn thử nghiệm trong phòng thí nghiệm, bước đầu đánh giá hợp chất M là có hiệu quả nhất đối với V. harveyi. Giai đoạn tiếp theo là tiến hành thí nghiệm đánh giá hiệu quả điều trị của hợp chất M đối với tôm đã cho nhiễm V.harveyi trong bể nuôi trong phòng Wet-lab. Hai nồng độ của hợp chất M được chọn để thử nghiệm là 500 và 750 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày. Sơ đồ tiến hành thử nghiệm được trình bày như sau:
Tôm không mang các mầm bệnh Lô đối chứng âm, 15 con Lô đối chứng dương, 15 con Lô thử nghiệm nồng độ 500 mg/kg, 15 con Lô thử nghiệm nồng độ 750 mg/kg, 15 con Tiêm 0,05 ml nước muối sinh lý Tiêm 0,05 ml dịch vi khuẩn Tiêm 0,05 ml dịch vi khuẩn Tiêm 0,05 ml dịch vi khuẩn
Theo dõi biểu hiện của tôm
Chăm sóc, theo dõi, đánh giá hiệu quả của thuốc đối với vi khuẩn
Cho tôm ăn thức ăn có tẩm
thuốc nồng độ 750 mg/kg Cho tôm ăn
thức ăn có tẩm thuốc nồng độ 500 mg/kg Cho tôm ăn thức ăn thường Cho tôm ăn thức ăn thường
Sơ đồ 2. Bố trí thử nghiệm trong phòng Wet-lab
Chuẩn bị 15 bể thí nghiệm, nước biển sau khi kiểm tra các tính chất hóa lý được cho vào mỗi bể 50 lít. Thí nghiệm bố trí thành 4 lô:
- Lô đối chứng âm: bố trí 3 bể, không gây cảm nhiễm, chỉ tiêm
0,05 ml dung dịch nước muối sinh lý và cho ăn thức ăn tổng hợp không tẩm hợp chất thử nghiệm.
- Lô đối chứng dương: bố trí 3 bể, các con tôm được gây cảm
nhiễm 0,05 ml dung dịch vi khuẩn (106 CFU/ml) và sử dụng thức ăn tổng hợp không tẩm hợp chất thử nghiệm.
- Lô thử nghiệm tác dụng của thuốc ở nồng độ 500 mg/kg: bố trí
3 bể, các con tôm được gây cảm nhiễm 0,05 ml dung dịch vi khuẩn (106 CFU/ml) và cho ăn thức ăn tổng hợp có tẩm hợp chất M với nồng độ 500 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày.
- Lô thử nghiệm tác dụng của thuốc ở nồng độ 750
mg/kg: bố trí 3 bể, các con tôm được gây cảm nhiễm 0,05 ml dung dịch vi khuẩn (106 CFU/ml) và cho ăn thức ăn tổng hợp có tẩm hợp chất M với nồng độ 750 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày.
Các con tôm sau khi tiêm được thả lại bể theo đúng bố trí. Chăm sóc và quan sát các dấu hiệu biểu hiện bệnh bằng cách so sánh với đối chứng âm và đối chứng dương. Quan sát theo dõi các biểu hiện của tôm, bắt đầu cho tôm ăn thức ăn có tẩm thuốc ngay khi có biểu hiện bệnh.