M Ở ĐẦU
a. Diện tích, sản lợng trồng lạc của các nớc trên thế giới
3.2.4. Phơng pháp PCR-SSR
Các cặp mồi SSR:
Mời lăm cặp mồi SSR đã đợc cung cấp từ Viện Nghiên cứu cây trồng màu Quốc tế cho vùng nhiệt đới bán khô hạn (ICRISAT). Trình tự mỗi mồi đơn dài từ 19 đến 25 nucleotide. Nhiệt độ gắn mồi và trình tự lặp lại của các nucleotide nh trong phụ lục 6. Trình tự các cặp mồi nh trong công bố của Ferguson (2004). Phản ứng SSR - Thành phần phản ứng PCR-SSR H2O 9,9 μl Đệm PCR 10X 2μl MgCl2 (25 mM) 2,5 μl dNTP (2,5 mM) 2 μl Mồi ngợc (10pM) 1 μl Mồi xuôi (10pM) 1 μl Taq polymease (5 U/μl) 0,4 μl ADN khuôn (5ng/μl) 2,0 μl Tổng thể tích 20 μl - Chu trình nhiệt B1 : 94oC trong 4 phút B2 : 92oC trong 45 giây B3 : 55-64oC trong 1 phút B4 : 72oC trong 1 phút B6 : trở về bớc hai 34 chu kỳ B5 : 72oC trong 10 phút B6 : lu giữ ở 4oC Điện di sản phẩm SSR
Khác với điện sản phẩm RAPD, điện di sản phẩm SSR bằng gel acrylamide 6%, bao gồm các bớc sau
- Chuẩn bị các tấm kính gồm một tấm kính dài và một tấm kính ngắn, rửa sạch bằng nớc cất và để khô 5 phút
- Lau tấm kính dài bằng dung dịch kết dính (dung dịch kết dính: thêm 4,5 àl Bind silane vào 1 ml dung dịch 95% etanol+ 0,5% axit acetic) và để khô trong 5 phút
- Chuẩn bị gel polyacrylamide 6%: 45ml nớc; 15ml TBE 10X; 15ml Acrylamide + Bis (29:1) 30% + 450àl APS 10% + 100àl TEMED
- Rót dung dịch polyacrylamide 6% vào xilanh, bơm vào khoảng giữa hai tấm kính sao cho dung dịch chảy đều và không có bọt khí. Cài lợc vào và để bản gel trong1 giờ, cho đông hoàn toàn. Sau đó cho vào máy điện di
- Chuẩn bị dung dịch để tra vào bản gel: Thêm 5 àl dye 3X vào 10 àl
sản phẩm PCR, trộn đều, sau đố tra vào mỗi giếng 4 àl mẫu
(Chú ý: Trớc khi tra mẫu và ADN marker vào gel, cho chạy điện di ở 1000V trong 15 phút)
- Chạy điện di: 600 V trong thời gian 3 giờ - Hiện hình
+ Sau khi điện di tách 2 tấm kính ra + Đặt bản gel vào nớc rửa 3 phút
+ Nhuộm gel 20 phút trong dung dịch CTAB 0,1% (1g CTAB +1l H2O)
+ Nhuộm gel 15 phút trong dung dịch ammoniac 0,3% (13 ml ammoniac+ 1l H2O)
+ Nhuộm gel 15 phút trong bạc (1g bạc + 4ml NaOH 1M + 3,5ml ammoniac)
+ Rửa bản gel trong nớc 10 giây
+ Nhuộm bản gel trong dung dịch hiện hình (15g Na2CO3+ 200àl
formaldehit) cho đến khi xuất hiện băng + Rửa bản gel trong nớc 10 giây
+ Cố định bản gel trong glycerol trong 15 phút + Để khô ngoài không khí