Các nghiên cứu in vitro chỉ ra rằng vi khuẩn sinh acid lactic cĩ khả năng ức chế sự
phát triển của vi sinh vật truyền nhiễm ở gia cầm. Chateau et al (1993) phân lập được 103 chủng Lactobacillus ssp từ hai sản phẩm DFM (cho ăn trực tiếp) thương mại và kiểm tra khả năng ức chế hai chủng Salmonella. Khoảng 47% Lactobacillus của sản phẩm A và 70% của sản phẩm B cĩ thểức chế tất cả 6 serotype E. coli.
Ozayabal và Coner (1995) báo cáo rằng 3 chủng thương mại (L. acidophilus, L.
casei và L. faecium) cĩ thểức chế sự phát triển của của 6 serotype Salmonella.
Jin et al (1996) phát hiện ra rằng tất cả 12 chủng Lactobacillus cĩ thể ức chế sự
phát triển của 5 chủng Salmonella và 3 chủng E. coli .
Các sản phẩm vi sinh từ Lactobacillus cĩ Bacteriocin, acid hữu cơ và hydroperoxyd. Bacteriocin là hỗn hợp của các sản phẩm vi sinh vật cĩ các thành phần protein sinh học chủđộng và hoạt động vi sinh (Tag et al, 1976).
Các chủng Lactobacillus cĩ ởđường ruột của người và một sốđộng vật thí nghiệm khác cũng sản xuất các chất giống Bacteriocin được gọi là Lactocidin (Vincent et al., 1995). Chất này họat động ở pH 5 - 7,8 và khơng mẫn cảm với các hoạt động xúc tác. Lactocidin thơ cĩ các hoạt động ức chế nhiều loại vi khuẩn bao gồm Proteus spp,
Salmonelle spp, E. coli và Staphylococcus spp. Vì Lactocidin cĩ phổ kháng khuẩn rất rộng. Vincent et al (1959) kết luận rằng L. acidophilus cĩ thểđĩng vai trị quan trọng trong việc kiểm sốt các vi sinh vật cĩ hại trong đường ruột của gia súc và người.
Hoạt động đối kháng bởi vi khuẩn lactic cĩ liên quan chặt chẽ với sản phẩm cuối của quá trình trao đổi chất. Hàng loạt các sản phẩm phụ của quá trình trao đổi do
Lactobacillus cĩ khả năng cĩ hoạt động đối kháng (trong phịng thí nghiệm). Các sản phẩm phụđược biết tới nhiều nhất là các acid hữu cơ như acid lactic, acetic (Trammer, 1966; Sorrel và speck, 1970) và hydro peroxid (Wheater et al, 1952) Dahiafa và Speck, 1968); Price và Lee, 1970). Các acid acetic, lactic ức chế sự phát triển của nhiều vi sinh vật gây bệnh Gram âm (Sorrel và Speck, 1970; Herrick, 1972): Adams và Hall (1988) phát hiện ra các hoạt động của các acid này phụ thuộc vào độ pH. Nếu độ pH thấp sẽ
tăng mức độ acid ở dạng khơng hịa tan. 2.4.2.3. Sự loại trừ cạnh tranh
Fuller (1977) báo cáo rằng các chủng Lactobacillus 59 và 74/1 cĩ khả năng giảm
E. coli trong diều và ruột non nhưng khơng làm giảm trong ruột già của gà.
Muralidhara (1977) tìm ra rằng tính đồng nhất của các mơ bào ruột non được cung cấp Lactobacillus lactic đã cĩ nhiều Lactobacilli hơn và ít E. coli hơn các động vật bình thường hoặc tiêu chảy.
Francis (1978) kết luận rằng việc thêm các chế phẩm Lactobacillus ở mức 75 mg/kg thức ăn đã giảm đáng kể (p < 0,05) số lượng Coliform trong ruột non và ruột thừa ở gà tây.
Watkin (1982) và Miller (1983) đã thấy sự giảm đáng kể E. coli trong đường dạ
dày ruột của gà đã được cho ăn, uống Lactobacillus acidophilus.
Tuy nhiên cĩ nhiều yếu tố cần phải lưu ý nếu muốn nhận được kết quả tốt khi sử
dụng probiotic. Trong đa số các trường hợp cần phải biết chắc chắn rằng các vi sinh vật cần phải sống sĩt và phát triển trong đường ruột phải cĩ khả năng sống trong mơi trường pH thấp và cĩ khả năng chống lại tác dụng của mật. Để sống được trong đường ruột, các chủng vi sinh vật cần cĩ khả năng đính vào và sinh sơi nảy nở ở trên bề mặt của ruột non. Mặc dù một vài tác giả đưa ra một số cơ chế giải thích tại sao vi sinh vật cĩ lợi trong đường ruột cĩ thểức chế sự thâm nhập của vi sinh vật cĩ hại (Rolfe, 1991) nhưng cơ chế chính xác của sự loại trừ cạnh tranh của vi sinh vật gây bệnh bằng probiotic vẫn chưa được khẳng định. Trong số các cơ chế này cĩ sự cạnh tranh về vị trí, cạnh tranh chất dinh dưỡng, cạnh tranh về khối lượng các chất sinh ra bởi vi sinh vật.
15 2.4.2.4. Tăng thức ăn ăn vào và khả năng tiêu hĩa
Hệ vi khuẩn đường ruột của động vật nuơi cĩ một vai trị quan trọng trong sự tiêu hĩa và hấp thụ thức ăn ăn vào của vật chủ. Chúng tham gia vào sự trao đổi chất của các chất dinh dưỡng như là carbon hydrat, protein, lipid và khống. Các chất này cũng cĩ vai trị trong sự tổng hợp các vitamin. Nahashon et al (1992, 1993, 1994, 1996) phát hiện rằng bổ sung lứa cấy Lactobacillus vào trong khẩu phần bắp/ lúa mạch/ đậu nành
đã kích thích tính thèm ăn và làm tăng tích lũy mỡ, nitơ, phospho, đồng và mangan cho gà đẻ.
2.4.2.5. Sự trao đổi chất của vi khuẩn. • Hoạt tính enzyme tiêu hĩa. • Hoạt tính enzyme tiêu hĩa.
Lactobacillus spp và Bacillus spp cĩ khả năng sản xuất enzyme tiêu hĩa trong điều kiện thí nghiệm và trong ruột. Chúng làm tăng khả năng tiêu hĩa các chất dinh dưỡng
đặc biệt trong ruột dưới (March, 1979; Sison, 1989).
Những enzyme chúng tiết ra gồm: amylase, protease, và lipase…(Jin et al,1996). Những enzyme này cĩ hoạt tính phân giải tinh bột, lipid và protein (Moon và Kim, 1989; Lee, 1990).
• Ngăn chặn sản sinh amoniac
Ngăn chặn sự sản sinh amoniac và hoạt động của urease cĩ thể là cĩ lợi để cải thiện sức khỏe gia súc và làm tăng cường sinh trưởng của gia súc bởi vì amoniac được sản sinh do sự phân giải urê trong màng nhày ruột non cĩ thể gây nên một sự thiệt hại
đáng kểđến bề mặt của tế bào.
Chiang và Hsieh (1995) báo cáo rằng probiotic (chứa L. acidophilus, S. faecium và B.
subtilis) làm giảm nồng độ amoniac trong phân và chất độn chuồng của gà Broiler.
2.4.3. Vai trị của probiotic
Probiotic tác dụng rất cĩ lợi đối với cơ thể con người và động vật như:
9 Trung hịa độc tố ruột.
9 Kích thích hệ thống miễn dịch, đặc biệt quan trọng trong sự phát triển khả năng miễn dịch ở gia súc non chống lại những kháng nguyên cĩ thể gây ra những phản ứng viêm. (Perdigon et. al,1990).
9 Khả năng gắn vào tế bào ruột nhằm loại bỏ hay hạn chế sự gắn của các tác nhân gây hại.
9 Tạo ra các acid, H2O2 và các Bacterion chống lại sự phát triển của các tác nhân gây bệnh.
9 An tồn, khơng lan truyền rộng, khơng gây ung thư và khơng gây bệnh (Lê Thị
Hồng Tuyết, 2004).
9 Giúp ích cho tiêu hĩa thức ăn đặc biệt một số loại vi khuẩn cĩ khả năng tổng hợp vitamin nhĩm B, vitamin K… Cĩ thể làm giảm cholestrol trong máu nếu sử dụng liều cao và thường xuyên. Giúp cải thiện được tình trạng khơng sử dụng được
đường lactose. Gần đây nhất cĩ nghiên cứu cho thấy người mẹ mang thai dùng thuốc cĩ chứa Lactobacillus, sau khi sinh tiếp tục dùng trong thời gian cho con bú cĩ thể giúp trẻ ngừa được một số bệnh dị ứng như eczema (Nguyễn Hữu Đức, Thuốc và sức khỏe số 202, 2001).
2.4.4. Một số chế phẩm probiotic cĩ chứa B. subtilis và L.acidophilus hiện nay
Hiện nay trên thị trường cĩ bán rất nhiều chế phẩm sinh học dưới nhiều dạng khác nhau. Những chế phẩm này được dùng trong chăn nuơi và thủy sản như:
• Enzymbiosub của cơng ty Vaccin và Sinh Phẩm Số 2 được dùng để phịng và trị
các bệnh tiêu chảy cấp, mãn tính, rối loạn đường tiêu hĩa của gia súc, gia cầm và cá, giúp tăng cường tiêu hĩa, kích thích tăng trưởng.
• Chế phẩm men vi sinh EBS của cơng ty Vaccin và Sinh Phẩm Số 2 được dùng kích thích tơm, cá sử dụng triệt để nguồn thức ăn, giúp tơm, cá tiêu hĩa tốt thức
ăn và tăng trọng nhanh. Cải thiện mơi trường nước, kích thích tảo cĩ lợi, phiêu sinh vật phù du cĩ trong ao nuơi, tạo nguồn thức ăn tự nhiên dồi dào cho tơm, cá. Ổn định hệ vi sinh vật cĩ lợi trong đường ruột, lấn át, tiêu diệt các vi khuẩn cĩ hại. Phịng và điều trị cĩ hiệu quả các bệnh đường tiêu hĩa, bệnh phân trắng, bệnh nhiễm trùng đường ruột cho tơm, cá…
• Baciflora For Shrimp của cơng ty liên doanh Bio – Pharmachemie cĩ tác dụng tượng tự như các chế phẩm trên.
• Vime-bactevit, của cơng ty Vemedim Vietnam được dùng cho cá, tơm cũng cĩ tác dụng tương tự.
• Lactogen của cơng ty Gấu Vàng được dùng cho heo gà cũng cĩ tác dụng tương tự. • Ngồi các chế phẩm trong nước cịn cĩ rất nhiều loại chế phẩm của nước ngồi được
17
2.4.5. Một sốđề tài đã nghiên cứu
2.4.5.1. Trong nước
• Theo Nguyễn Văn Đơng (1993) đã khảo sát một số tính chất của vi khuẩn
Bacillus subtilis dùng sản xuất chế phẩm Biosubtyl để phịng và trị bệnh tiêu chảy cho heo con. Ghi nhận vi khuẩn Bacillus subtilis khơng cĩ độc lực khi truyền qua đường tiêu hĩa, cĩ khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh:
Staphylococcus aureus, E.coli.
• Năm 2001, Đậu Ngọc Hào, Phạm Minh Hằng, Nguyễn Chí Quốc đã nghiên cứu một số đặc tính trợ sinh học (probiotic) của Bacillus subtilis trong phịng bệnh
đường tiêu hĩa của gà và ghi nhận rằng Bacillus subtilis cĩ khả năng ức chế sự
sinh trưởng và phát triển của E. coli invitro. Gà được ăn chế phẩm Bacillus subtilis ở lượng 106 cfu/g cĩ thể ổn định hệ vi sinh vật đường tiêu hĩa đặc biệt là E. coli, và cĩ thể tồn tại trong chế phẩm với thời gian bảo quản là 6 tháng. • Tạ Thị Vịnh và cộng tác viên (2002) đã nghiên cứu sử dụng chế phẩm Vitom3
(Bacillus subtilis chủng VKPMV – 7092) để phịng trị bệnh phân trắng cho heo con ghi nhận rằng Vitom3 cĩ tác dụng kích thích tăng trọng, phịng bệnh heo con phân trắng, tỷ lệ mắc bệnh giảm 11%, tỷ lệ khỏi bệnh 100% và khơng cĩ heo bị tái phát.
• Đinh Văn Cải, Phạm Hồ Hải và Võ Thị Hạnh (2004) đã nghiên cứu sản xuất và sử
dụng các chế phẩm sinh học cĩ nguồn gốc từ các loại men vi sinh bổ sung vào khẩu phần ăn của bị vắt sữa và bê sau cai sữa đã kết luận rằng bê được bổ sung 50 gam BIO-C tăng trọng cao hơn từ 48 – 49 g/ con/ ngày so với bê khơng bổ sung.
• Nguyễn Thị Lam Kiều, 2004 “Khảo sát đặc điểm sinh học của hai chủng Lactobacillus trong men tiêu hĩa” ghi nhận chúng cĩ khả năng chịu được mật từ 0,2 – 0,6%, ức chế
E. coli và cĩ khả năng sinh acid và tiêu thụđường.
• Tăng Thị Rít, Nguyễn Thị Bích Thủy, Quan Quốc Đăng và Nguyễn Kim Trinh, 2004 đã tổng hợp chế phẩm sinh học SH bổ sung vào thức ăn tơm sú Penaeus
monodon nhằm kích thích tăng trưởng và tăng sức đề kháng bệnh đốm trắng. Kết quả tỷ lệ pha trộn 1% chế phẩm vào thức ăn của tơm giúp tăng trọng hơn 10% và tỷ lệ tơm sống sĩt trên 80% sau 30 ngày gây nhiễm nhân tạo bệnh đốm trắng so với khoản 20% của lơ khơng cĩ bổ sung chế phẩm.
2.4.5.2. Ngồi nước
• Nhĩm nghiên cứu của Alexopoulos (Đức) đã nghiên cứu hiệu quả của chế phẩm Bioplus 2B (chứa Bacillus subtilis và Bacillus licheniformis) lên trình trạng sức khỏe, tính năng sinh đẻ của heo nái và lên chất lượng thịt của heo thịt. Kết quả ghi nhận được khi bổ sung chế phẩm Bioplus 2B cho heo nái con và mẹ làm hạn chế
sự giảm trọng lượng của heo mẹ trong thời kỳ tiết sữa (15,3 ± 3,6 đối với chế phẩm Bioplus 2B so với đối chứng là 18,8 ± 3,1. Làm cải thiện các thơng số của máu và sữa (ngoại trừ lactose và chất rắn).
Ngồi ra nhĩm nghiên cứu cịn kết luận chế phẩm Bioplus 2B cĩ ảnh hưởng
đến tình trạng sức khỏe và tính năng sinh sản của heo nái và làm tăng phẩm chất quầy thịt ở heo đang lớn.
• Nhĩm nghiên cứu của Sirirat Rengpipat (Thái Lan) về tác dụng của probiotic trong nuơi tơm sú (Penaeus monodon) ghi nhận rằng Bacillus dịng S11 khơng hạn chế quá trình nở của Artemia, làm tăng trọng lượng và chiều dài của ấu trùng tơm (trọng lượng là 43,8 mg so với 26 mg so với đối chứng, chiều dài (cm) là 1,83 ± 0,31 so với đối chứng là 1,71 ± 0,2. Tơm cĩ tỷ lệ sống sĩt cao (13% so với 4%
đối chứng) khi thử nghiệm với Virio harveyi (vi khuẩn gây bệnh phát sáng). Ngồi ra nhĩm cịn kết luận Bacillus dịng S11 khơng cĩ ảnh hưởng đến chất lượng nước ao nuơi và Arterma là vật mang probiotic cĩ hiệu quả.
2.5. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME
Enzyme hay cịn gọi là “men” là chất xúc tác sinh học cĩ bản chất là protein. Chúng cĩ trong tế bào của mọi cơ thể sinh vật. Enzyme khơng những làm nhiệm vụ xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hĩa học nhất định trong cơ thể sinh vật (phản ứng của các quá trình trao đổi chất trong tế bào cơ thể sống) gọi là “invivo” mà nĩ cịn xúc tác cho các phản ứng ngồi tế bào “invitro”. Vì cĩ nguồn gốc từ sinh vật nên enzyme cịn được gọi là chất xúc tác sinh học nhằm phân biệt với các chất xúc tác hĩa học khác.
19
2.5.1. Enzyme amylase
Hệ enzyme amylase là một trong số các hệ
enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong cơng nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác trong đời sống.
Những nghiên cứu đầu tiên về enzyme amylase được bắt đầu vào những năm 1811 -
1814. Các enzyme amylase cĩ trong nước bọt, dịch tiêu hĩa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Cho mãi tới thời gian gần đây người ta mới thu nhận amylase từ malt. Hiện nay người ta thu amylase từ canh trường vi sinh vật chủ yếu là từ vi khuẩn, nấm mốc và một số lồi nấm men (Nguyễn Quyết, 2004).
Hình 2.3. Enzyme α-amylase
2.5.1.1. Đặc điểm enzyme α-amylase
Enzyme amylase cĩ thể thu được từ động vật, thực vật và vi sinh vật. Hiện nay người ta đã biết enzyme amylase được vi khuẩn và nấm sợi tổng hợp nhiều nhất, cịn ở
các lồi vi sinh vật khác khả năng này yếu hơn.
Các loại enzyme amylase thường gặp khi nuơi cấy vi sinh vật gồm: α-amylase (α- 1,4 glucan-4-glucanhydrolase), ß-amylase (α-1,4glucan-4-maltohydrolase), γ-amylase (glucoamylase). Trong đĩ vi khuẩn Bacillus subtilis cĩ thể tổng hợp nên α-amylase.
α-amylase thủy phân liên kết α -1,4 glucoside ở giữa mạch polysaccharide chính vì thế nhiều tài liệu cịn gọi chúng là endoamylase.
Dưới tác dụng của α-amylase tinh bột sẽ mất khả năng tạo màu với iod và độ nhớt bị giảm rất nhanh, α-amylase thường bền nhiệt hơn các loại amylase khác. Khi cĩ mặt ion calci cấu trúc của α-amylase sẽ bền hơn, và kém bền trong mơi trường acid.
Khi α-amylase tác dụng vào tinh bột, sản phẩm tạo thành của phản ứng này bao gồm: dextrin (trong đĩ chủ yếu là dextrin phân tử lượng thấp), maltose, glucose.
α-amylase từ nguồn khác nhau cĩ thành phần acid amin khác nhau, song chúng đều cĩ khá nhiều tyrosin và tryptophan cịn methionin rất ít và chỉ cĩ khoảng 7 - 10 gốc cystein.
α-amylase của Bacillus subtilis khơng cĩ các liên kết disulfit và disunithidin. Hoạt độ
của chúng cĩ liên quan mật thiết với sự cĩ mặt của ion calci trong phân tử vì ion này được dùng để duy trì hình thể hoạt động của enzyme, từđĩ nĩ cĩ vai trị quan trọng trong việc
ổn định hoạt tính của enzyme và tăng cường độ bền của α-amylase trước các tác nhân gây biến tính và tác dụng phân hủy protease.
Phản ứng thủy phân tinh bột bằng α-amylase thường xảy ra hai giai đoạn:
• Giai đoạn đầu: Chỉ một số liên kết trong phân tử bị đứt và độ nhớt của hồ
tinh bột giảm nhanh, người ta gọi đây là giai đoạn dịch hĩa.
• Giai đoạn 2: thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa được tạo thành. Nhờ đĩ tinh bột cĩ thể chuyển thành maltotriose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thơng thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp khơng cho màu với iốt và một ít maltose.
Theo số liệu của Liphsis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hĩa và đường hĩa của chế phẩm amylase từ Bacillus subtilis là giống nhau và nằm trong vùng pH 5,6 – 6,2. Cịn số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hĩa của nĩ là 6 – 7, bị vơ hoạt hồn tồn ở pH = 1 và bị vơ hoạt một phần ở pH = 8.
2.5.1.2. Ứng dụng của α-amylase
Amylase là một trong những enzyme quan trọng nhất trong ngành cơng nghệ sinh