Μl dung dịch DEPC

DEPC

Hình 2.6: Quy trình tách chiết DNA trong huyết thanh (xem thêm phụ lục)

2. 3.3. Phương pháp Real-Time PCR

Phản ứng Real-Time PCR sử dụng TaqMan probe được thiết lập với 5 µl DNA-CMV với 20 µl master mix pha từ iTaq DNA Polymerase (Bio-Rad), phản ứng Real-Time PCR sử dụng PCR Amp/Cycle Graph với FAM-490.

Chương trình luân nhiệt được tiến hành như sau: 1 Chu kỳ 95,0ºC 15 phút

40 Chu kỳ 95,0ºC 15 giây 57,0ºC 1 phút 72,0ºC 20 giây

Việc phân tích kết quả sau phản ứng luân nhiệt được thực hiện với phần mềm iCycler (Bio- rad) theo đúng hướng dẫn sử dụng.

2.3.4. Phương pháp khảo sát tối ưu hóa điều kiện phản ứng Real-Time PCR [1], [15]. 2.3.4.1.Khảo sát nhiệt độ lai:

Nhiệt độ lai là một chỉ tiêu quan trọng ảnh hưởng lớn đến kết quả của phản ứng PCR. Nhiệt độ lai quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng không tốt đến hiệu quả nhân bản của phản ứng PCR.

Nhiệt độ lai quá thấp so với nhiệt độ biến tính của cặp primer sử dụng dễ tạo nên các sản phẩm ký sinh không mong muốn trong phản ứng, còn nhiệt độ lai quá cao sẽ cản trở sự bắt cặp của primer vào DNA bản mẫu, do đó hiệu quả nhân bản sẽ không cao.

Công thức tính nhiệt độ lai:

1. Công thức chính xác với primer dài không quá 20nu:

Tm= [4(G+C)+2(A+T)]0C. Đây là công thức Wallace chung nhất hay được sử dụng, xác định gốc phân tử lai oligonucleotide, được thực hiện trong 1M NaCl, ở nồng độ muối thấp.

2. Công thức này dùng cho primer có độ dài 14-70nu: Tms={81,5+16,6(log10[J+]+0,41(%G+C)-(600/l)}0C

[J+] là nồng độ phân tử của cation hóa trị đơn và l= độ dài oligonucleotide,

(%G+C) là giá trị thực chứ không phải giá trị phân số (ví dụ: (%G+C)=90% là 90 chứ không phải 0,90).

3. Công thức này dùng cho primer có độ dài 20-35nu: Tmp={22+1,46[2(G+C)+(A+T)]0C

Nhiệt độ primer tính theo lý thuyết là nhiệt độ tham khảo, nhiệt độ bắt cặp thực sự có thể cao hơn 3-120C so với nhiệt tính toán.

Chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ lai của từng cặp primers trên một gradient nhiệt độ, khảo sát ở các giếng khác nhau trong khoảng 55-650C, và đọc kết quả so sánh.

2.3.4.2.Khảo sát nồng độ MgCl2+ [4], [15]

Trong dung dịch đệm quan trọng nhất là ion Mg2+ làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm-melting temperature) của DNA mạch đôi, tạo ra phức chất tan với dNTPs để hình thành cơ chất mà enzyme polimerase có thể nhận ra, điều này rất cần thiết cho quá trình liên kết của các dNTP.

Nồng độ Mg2+ trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng biến đổi từ 0,5-5,5mM (nồng độ này có thể thay đổi khi cần thiết). Nồng độ Mg2+ quá thấp sẽ làm giảm khả năng tổng hợp của enzyme polymerase, hiệu suất thu sản phẩm thấp hoặc không có sản phẩm, còn nếu nồng độ quá cao sẽ tạo ra những phân đoạn không đặc hiệu (primer sai vị trí).

Nhìn chung, nồng độ MgCl

2 có ảnh hưởng nhiều tới hiệu quả và tính đặc thù của phản ứng. Ngoài Mg2+ còn một số chất khác trong dung dịch đệm như AMSO, DMSO, formamide được thêm vào như các chất phụ gia nhằm tạo ra các sản phẩm PCR có kích thước lớn.

2.3.4.3.Khảo sát nồng độ primer và TaqMan probe [1] * Thăm dò nồng độ primer

Lượng primer đưa vào phản ứng PCR phải phù hợp với lượng DNA cần tổng hợp. Nếu nồng độ primer quá thấp thì primer sẽ hết trước khi số chu kì kết thúc, còn nồng độ primer quá cao thì sẽ dễ làm tăng sản phẩm không đặc hiệu. Nồng độ primer không được cao quá, vì các phân tử Mg 2+ bị cặp hết làm giảm hoạt tính enzym, thể tích mẫu không vượt quá 1/10 thể tích. Trên 200M, thì phải tối ưu lại Mg, tránh sử dụng đệm EDTA vì EDTA bắt kẹp Mg2+.

Nồng độ primer thường 0,2M là đủ cho các primer tương tự, cũng có thể sử dụng đến 3M, nhưng tỷ lệ giữa primer và khuôn cao có thể cho kết quả khuyếch đại không đặc hiệu và tạo ra cấu trúc nhị phân primer.

Nồng độ primer trong mỗi phản ứng PCR phải được tính toán tối ưu bằng thực nghiệm. Nồng độ primer thích hợp để tiến hành phản ứng PCR là từ 0,1-0,5μM.

* Thăm dò nồng độ TaqMan probe để có cường độ huỳnh quang là cao nhất, không phải hàm lượng TaqMan cao là cho cường độ phát huỳnh quang cao, ngược lại sẽ làm các phân tử TaqMan probe quá gần nhau nên huỳnh quang phát ra từ đầu reporter của TaqMan probe được thủy giải sẽ bị các quencher của các TaqMan probe khác hấp phụ. Thông thường từ 2-5pm cho mỗi thể tích phản ứng.

Vì vậy, chúng tôi chọn phổ nồng độ TaqMan probe từ 100nM-500nM.

2.3.5. Phương pháp khảo sát độ nhạy và khả năng nhân bản chọn lọc của primer và TaqMan probe.

2.3.5.1. Khảo sát độ nhạy

Bất kỳ phương pháp nào, các đối tượng mục tiêu cũng chỉ có thể được phát hiện ở một nồng độ giới hạn của chúng trong mẫu. Một phương pháp tốt khi nó có thể phát hiện được đối tượng quan tâm ở nồng độ càng thấp càng tốt. Do đó, đây là một chỉ tiêu quan trọng dùng để đánh giá mức độ hiệu quả của phương pháp.

Trong nghiên cứu này, để xác định độ nhạy của primer, chúng tôi tiến hành pha loãng bậc 10 liên tiếp mẫu ban đầu (đã biết trước nồng độ) thành nhiều nồng độ khác nhau. Ở mỗi nồng độ chúng tôi tiến hành khảo sát với những điều kiện tối ưu đã được khảo sát từ các thí nghiệm trên. Từ đó chúng tôi sẽ xác định nồng độ thấp nhất mà phương pháp vẫn cho kết quả rõ ràng và chính xác.

2.3.5.2. Khảo sát khả năng nhân bản chọn lọc của primer và TaqMan probe

Một yêu cầu quan trọng của hệ primers và TaqMan probe là nó phải khuếch đại đúng trình tự mục tiều cần quan tâm. Ngoài trình tự mục tiêu của loài đang khảo sát, primer và probe không được bắt cặp lên các trình tự của loài khác. Do đó việc xác định khả năng nhân bản chọn lọc của primer luôn luôn được đòi hỏi. Việc xác định này phải được thực hiện trên cả lý thuyết và thực nghiệm.

Trên lý thuyết, chúng tôi sử dụng phần mềm Annhyb 4.942 để kiểm tra sự bắt cặp của primer trên genome của một số loài cùng họ như HSV1, HSV2, EBV và một số loài khác HBV, HCV, HPV, MTB…..

Trên thực nghiệm đối với mỗi tác nhân, chúng tôi tiến hành song song hai phản ứng Real- Time PCR. Một chúng tôi dùng hệ primers và TaqMan probe đã thiết kế chạy với những mẫu bệnh phẩm nhiễm HSV1, HSV2, EBV, HBV, HCV, HPV,MTB đã được khẳng định dương tính. Một phản ứng với các cặp primer-TaqMan probe đặc hiệu cho từng tác nhân.

2.3.6. Phương pháp giải trình tự (sequencing)

Để biết sản phẩm khuyếch đại thu được là đặc hiệu của vùng gen UL123–CMV đã thiết kế theo gene bank, sản phẩm phải được gửi đi giải trình tự nucleotide, ở công ty Macrogenn Inc (Hàn quốc).

Nguyên tắc đoạn DNA cần được giải được chạy Real-Time PCR, sau đó mỗi mạch của phân tử DNA sẽ bắt cặp với một primer, thường là mổi sử dụng trong phản ứng Real-Time PCR, xảy ra với sự có mặt của dideoxyribonucleotide đã được đánh dấu bằng mỗi màu khác nhau.

2.3.7. Phương pháp xây dựng đường chuẩn (Standard curve)

Đường cong chuẩn được xây dựng với các mẫu chuẩn đã có nồng độ DNA-CMV biết trước. Sau đó, hàm lượng sản phẩm PCR của mẫu xét nghiệm sẽ được xác định bằng cách so sánh với hàm lượng sản phẩm PCR từ các mẫu chuẩn được nhân bản cùng lúc thông qua đường cong chuẩn vừa xây dựng này [2].

CHƯƠNG 3: