2.1. Mẫu bệnh phẩm
Mẫu máu, mẫu nước tiểu của những người nghi ngờ nhiễm CMV đã được xác định dương tính bằng phương pháp tìm kháng thề IgG, IgM ở bệnh viện Từ Dũ, trung tâm y khoa Medic, và xác định bằng PCR tại Công ty cổ phần công nghệ Việt Á.
Mẫu HSV1, HSV2 cung cấp từ trung tâm y khoa Medic đươc khẳng định dương tính bằng phương pháp miễn dịch kháng thể.
Mẫu huyết thanh khẳng định có chứa HBV, HCV, HPV, EBV, MTB được xác định dương tính bằng Real-Time PCR ở công ty cổ phần công nghệ Việt Á.
2.2. Vật liệu
2.2.1. Các thiết bị dụng cụ [2]
Gồm các thiết bị cơ bản (xem phụ lục): - Ống eppendorf 0,2ml, 1,5ml
- Pipetman1000l, 200l, 100l, 10l và các đầu tip tương ứng - Ống nghiệm, ống hút, becher, đĩa petri, giá đỡ ống nghiệm.
- Máy ủ nhiệt, máy ly tâm siêu tốc, máy Real-Time PCR, máy vortex, máy vi tính các phần mềm chuyên dụng để thiết kế và đánh giá primer, thiết kế phản ứng PCR, tủ cấy vô trùng, tủ lạnh, tủ hút khí độc, bàn đèn tử ngọai…
Vật liệu tiêu hao: găng tay không phấn, đầu tip có phin lọc…. 2.2.2. Hóa chất [2]
2.2.2.1. Hóa chất dùng tách chiết DNA + Proteinase K
+ Dung dịch 1: triozol (phenol 38%, guanidium thyocinate 0,8M, glycerol5%), chỉnh pH=8. + Dung dịch 2: chloroform.
+ Dung dịch 3: izopropanol tuyệt đối có chứa chất trợ tủa. + Dung dịch 4: ethanol 70%.
+ Dung dịch 5:dung dịchTE 1X (tris 0,1M-EDTA 0,001M). 2.2.2.2. Hóa chất dùng trong Real-Time PCR
+ DNA-CMV được tách chiết bằng phenol chloroform
+ Primer (mồi) xuôi, primer ngược, TaqMan probe đã được công ty IDT (Intergrated DNA Technologies) của Mỹ thiết kế.
+ PCR master mix (Pha PCR mix cho Real-Time PCR dùng TaqMan probe): Thể tích hỗn hợp phản ứng là 25 µl bao gồm:
1. PCR buffer 1X-
2. 1,5 unit Taq DNA polymerase có họat tính 5’-3’ exonuclease 3. dNTP=400µM/L/ mỗi loại dATP, dGTP, dCTP và dTTP 4. 10-25pm primer xuôi, primer ngược
5. 2-5pm TaqMan probe 6. 3-5mM MgCl2
7. Thêm dUTP, hoặc UNG giảm khả năng ngoai nhiễm 2.3. Phương pháp [1], [4], [8], [10], [15], [22], [57], [64], [68]. 2.3.1. Thiết kế hệ primers (mồi) và TaqMan probe
Trong đề tài này chúng tôi thực hiện phương pháp Real-Time PCR kiểu phản ứng sử dụng TaqMan probe. Các bước để phát triển một phản ứng TaqMan probe là
1. Thiết kế primers và TaqMan probe.
2. Đánh giá tính hiệu quả và tối ưu hóa phản ứng.
Để thiết kế hệ primers và probe có nhiều phần mềm dùng để thiết kế và chúng tôi sử dụng các phần mềm sau:
Clustal X 2.0
Annhyb 4.922 năm 2004 (Olivier Friard, Hoa Kỳ) Phần mềm trực tuyến BLAST ( NCBI)
ww.ncbi.nlm.nih,gov/BLAST/
Phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3,0 (IDT, Hoa Kỳ) www.scitool.,id.,com/scitools/Applications/OligoAnalyzer/
Một phản ứng Real-Time PCR thành công đòi hỏi sản phẩm phải được khuyếch đại (trình tự đích) đặc hiệu và hiệu quả. Thiết kế primer phù hợp với trình tự đích là rất quan trọng, vì vậy, việc chọn trình tự đích (sản phẩm khuyếch đại) cần tiến hành trước.
2.3.1.1. Chọn sản phẩm khuyếch đại A- Nguyên tắc:
- Sản phẩm khuyếch đại từ 75-200bp. Trình tự càng ngắn thì hiệu quả khuyếch đại càng cao. Tuy nhiên chúng phải dài hơn 75 bp để có thể dễ dàng phân biệt với các trình tự primer- dimer có thể đựơc tạo ra.
- Cần tránh cấu trúc thứ cấp ở nhiệt độ bắt cặp hay không, (kiểm tra bằng cách sử dụng chương trình mfold: http://www.bioinfo.rpi.edu/ applications/ mfold/, hoặc xem tập san Bio- Rad 2593).
- Tránh một base đơn được lặp lại hơn 4 lần liên tục trên khuôn DNA - Duy trì hàm lượng G, C ở 50-60%.
* Sản phẩm khuyếch đại được chọn là một đoạn trình tự gen UL123 (CMV), mã hóa protein 72KDa
B- Cách tiến hành
- Đầu tiên tải tất cả trình tự nucleotide của gen UL 123(CMV) từ ngân hàng dữ liệu gen NCBI (National Center for Biology Information) trên internet www,ncbi,nlm,gov và lưu lại trong unitled-notepad.
- Sau đó so hàng (alignment) các trình tự tải về bằng phần mềm ClustalX 2.0.
ClustalX là một phần mềm (giao diện Windows) dùng để so sánh tương đồng nhiều trình tự DNA hay trình tự protein. Nó mô tả kết quả bằng hệ thống các màu sắc và làm nổi bật những nét đặc trưng trong những đoạn tương đồng.
Cách sử dụng chương trình ClustalX2.0
Để nhập dữ liệu cho chương trình ClustalX, thực hiện các bước sau: Mở chương trình ClustalX trên Desktop
Lựa chọn chức năng Multiple Alignment Mode Từ Menu File, chọn Load Sequences
Trong hộp Open, chọn tập tin chứa các trình tự cần so sánh, nhấn nút Open.
Hình 2.1: Nhập trình tự cho chương trình ClustalX
Hình 2.2: Kích hoạt open sắp gióng cột trong chương trình ClustalX
Để thực hiện sắp gióng cột các trình tự nhập vào, chúng ta chọn Do complete alignment trong menu Alignment. Xác định vị trí cho file lưu rồi nhấn nút OK.
Kết quả xuất hiện các trình tự so sánh tương đồng. Các vị trí nucleotide hay amino acid giống nhau sẽ được thể hiện cùng một màu sắc, mỗi loại một màu, và được đánh dấu *. Ta có thể biết được độ tương đồng của các trình tự thông qua sự tương đồng về màu sắc và chọn đoạn tương đồng cao làm trình tự đích.
Hình 2.3: Thể hiện kết quả sắp gióng cột trong chương trình ClustalX
2.3.1.2. Thiết kế hệ primers và TaqMan probe
Thiết kế primer: đây là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong phản ứng PCR, có vai trò làm primer cho hoạt động kéo dài mạch của DNA polymerase. Do đó, việc thiết kế primer phải được tiến hành thật chính xác, tránh ảnh hưởng đến hiệu quả và độ chuyên biệt của phản ứng PCR.
Nguyên tắc thiết kế primer: - Hàm lương GC từ 50-60%.
- Nhiệt độ nóng chảy (Tm) từ 50-650C. Giá trị Tm được tính bằng phương pháp lân cận gần nhất với giá trị của 50mM nồng độ muối và 300nM nồng độ oligonucleotide.
- Tránh cấu trúc thứ cấp.
- Tránh lặp lại base G, C hơn 3 lần.
- Thiết kế base G và C ở đầu và cuối primer. Thành phần 5 nucleotide cuối cùng ở đầu 3’ không nên có hơn 2G hoặc C nhằm tránh hiện tượng nhân bản ký sinh trong phản ứng PCR.
- Kiểm tra trình tự của primer xuôi và ngược để đảm bảo không có sự bắt cặp ở đầu 3’( tránh tạo ra primer-dimer).
- Kiểm tra sự đặc hiệu bằng những công cụ như Basic Local Alignment Search Tool (http://www.ncbi.gov/blast/)
Thiết kế TaqMan probe: Nguyên tắc thiết kế TaqMan probe:
- TaqMan probe có nhiệt độ nóng chảy cao hơn primer 5-100C (vì ở giai đọan 600C là nhiệt độ bắt cặp tối ưu của TaqMan probe, TaqMan probe sẽ bắt cặp vào sợi đích trước, rồi primer mới bắt cặp) .
- Ngắn hơn 30 nucleotide và không có base lọai G ở đầu 5’ bởi vì nó có thể hấp thụ tín hiệu hùynh quang ngay cả khi TaqMan probe bị cắt đứt.
- Trình tự TaqMan probe cần có hàm lượng GC từ 30-80% và TaqMan probe phải có nhiều base C hơn base G.
- Vị trí bắt cặp ở đầu 5’ của TaqMan probe nhưng không kéo dài đầu 3’ của primer, cách vị trí 3’ của primer bắt cặp trên cùng sợi đích khoảng 2-5 base.
- Quan trọng là lựa chọn chất phát và chất hấp thụ hùynh quang .
Đề tài chọn kiểu phản ứng singleplex, cho nên probe sẽ chọn chất FAM (6- carboxyfluorescin) làm chất phát huỳnh quang, và TAMRA (6-carboxytetra-methylrhodamine) làm chất hấp thụ huỳnh quang vì giá thành thấp, có sẵn, hiệu quả tốt và tín hiệu có thể phát ra bởi bất kỳ thiết bị nào hiện có.
Cách tiến hành thiết kế hệ primers và TaqMan probe Cách sử dụng phần mềm ClustalX
Sau khi chạy ClustalX các đoạn gene UL123 tải về, so sánh trình tự và xác định vùng bảo tồn (vùng có các trình tự tương đồng của tất cả các đoạn gene), và dựa vào các cặp primer và TaqMan probe đã được công bố trên các bài báo uy tín quốc tế [26], [42], [48], [56], [58], [69] để chọn primer và TaqMan probe, chạy ClustalX các đoạn gene UL123 với từng primer xuôi, primer ngược và TaqMan probe, đánh giá mức độ tương đồng của các đoạn trên.
Mở chương trình ClustalX đã gióng cột.
Hình 2.4: Minh họa cách gióng cột primer trong ClustalX
Ta được:
Hình 2.5: Primer được nối vào cột ClustalX
Tiếp tục vào menu alignment/ Do complete alignment/ khai báo địa chỉ lưu/OK ta được kết quả sắp gióng cột primer xuôi, primer ngược, và TaqMan probe (mẫu dò) (hình 3.1, hình 3.2, hình 3.3).
Cách sử dụng phần mềm Blast
Sau bước đánh giá mức độ tương đồng của các đoạn trên, ta phân tích và đánh giá hệ primers, probe về Tm, %GC, hairpin (kẹp tóc), self–dimer, hetero– dimer, độ tương đồng, kích thước sản phẩm PCR tạo thành bằng các chương trình BLAST, Annhyb4-922, Oligo Analyzer 3,0 của IDT (http://scitools,idtdna,com/ analyzer/oligocal,asp).
Vào http://blast,ncbi,nlm,nih,gov/Blast,cgi Chọn nucleotide blast
Trong vùng : Choose Search Set, dòng database : chọn nucleotide colletion
Trong vùng : Program Selection, chọn Optimize for Somewhat similar sequences (blastn).
Coppy cấu trúc primer vào vùng Enter Query Sequence, và click nút blast, kết quả tương đồng giữa primer và probe giúp ta xác định độ đặc hiệu của primer và probe được thiết kế so với gen CMV.
Cách sử dụng phần mềm Annhyb 4.942
AnnHyb 4.942 (Annealing and Hybridization) là phần mềm miễn phí dùng để phân tích trình tự nucleotide với các đặc trưng như chuyển đổi qua lại giữa các định dạng trình tự, dịch mã, phân tích bảng đồ cắt giới hạn, tìm motif, khung đọc mở.
Mở phần mềm Annhyb 4.942 Vào Menu Oligo, chọn New Oligo Phần Name: Nhập tên đoạn Oligo vào
Note: Chọn màu đoạn primer, hoặc TaqMan probe Seq, 5’: Nhập trình tự primer hoặc TaqMan probe vào
Ta vào Menu Oligo, chọn Align Oligo with Sequences. Ta có kết quả Align của primer và trình tự.
Cách sử dụngOligo Analyzer 3.0 của IDT
Vào http://www,idtdna,com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ Vùng : Sequence nhập trình tự mối và probe theo chiều 5’- 3’,
Để kiểm tra cấu trúc thứ cấp nào thì ta chọn vùng đó, sau đó click nút submit Để kiểm tra đặc tính ta chọn analyze.
Từ đó chọn cặp primers, TaqMan probe tốt nhất để chạy phản ứng Real - Time PCR. Gởi công ty IDT (Intergrated DNA Technologies) của Mỹ thiết kế.
2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA –CMV
Có thể tách chiết DNA-CMV từ nhiều dịch sinh học khác nhau như máu, nước tiểu, hoặc dịch sinh học khác. Và cũng có nhiều phương pháp khác khau để tách chiết DNA như phương pháp BOOM, CTAB, hoặc phenol-chloroform. Mỗi phương pháp sẽ có một nguyên tắc riêng, nhưng nguyên tắc chung là:
1. Phá vỡ tế bào, màng và phân hủy protein để giải phóng DNA.
2. Xử lý bằng nhiệt để phá hủy hoàn toàn protein, giải phóng DNA ra khỏi nhân. 3. Tách DNA ra khỏi đệm tách và bào quản DNA ở 4 đến 200C.
Riêng đề tài này chúng tôi chọn phương pháp tách chiết bằng phenol chloroform [2]. Nguyên tắc: mẫu bệnh phẩm khi trộn với dung dịch phenol /chloroform /Izoamyl alcohol(P/C/I=25:24:1) thì các protein trong mẫu sẽ bị phenol làm biến tính và vón cục lại. Khi ly tâm, nhờ có sự hiện diện của chloroform, các vón cục sẽ bị tách ra và tập trung trong lớp phân cách
giữa nước và P/C/I (Chloroform thường đi kèm với phenol có tác dụng bổ sung và làm mất hoàn toàn dấu vết của phenol, Chloroform cũng làm biến tính protein nhưng yếu hơn phenol).
Pha nước chứa DNA sẽ được lấy ra và làm kết tủa trong izopropanol có bổ sung chất trợ tủa (chất trợ tủa có tác dụng bắt các phân tử DNA, nhưng không ức chế phản ứng PCR). Khi thực hiện với sự có mặt của chất trợ tủa, quá trình tủa có thể xảy ra ở nhiệt độ phòng với thời gian ngắn (10 phút). Trong điều kiện không có chất trợ tủa, quá trình tủa phải thực hiện ở - 200C trong ít nhất 1 giờ.
DNA sau khi được tủa sẽ rửa lại 1 lần với ethanol 70% và cuối cùng được bảo quản trong TE1X (T: Tris có vai trò ổn định pH và E: EDTA bắt các ion Mg2+ làm cho DNase không hoạt động).
2.3.2.1. Quy trình xử lý nước tiểu và tách chiết DNA trong nước tiểu [17], [18], [19], [25], [26], [34],[35], [37], [40], [43], [44], [61].
Phương pháp này sử dụng proteinase K để thủy giải toàn bộ proteine có trong mẫu nước tiểu. Bước 1: Lấy 6 ml nước tiểu cho vào fancol 15ml, ly tâm tốc độ 4000v/p trong 30phút
Bước 2: Đổ bỏ dịch nổi, thu cặn và cho vào 200µl TE1X (0,1M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA- pH=8,0) +0,1% SDS và 40µg proteinase K, ủ ở 370C trong 3 giờ, tốt nhất là ủ qua đêm. Sau đó có thể đun nóng mẫu ở 1000C trong vài phút để bất hoạt proteinase K còn lại. Mẫu thử lúc này có thể sẵn sàng để tách chiết DNA.
Bước 3: Lấy 200 µl mẫu tiến hành tách chiết DNA bằng tủa phenol : cloroform: isoamylalcool (25:24:1) giống quy trình tách chiết DNA trong huyết thanh.
2.3.2.2. Quy trình tách chiết DNA trong máu hoặc huyết thanh, nước tiểu (hình 2.6): Bước 1: Đánh dấu các tube 1,5ml vô trùng bằng ký hiệu mẫu.
Bước 2: Cho 200l mẫu vào 1 tube vô trùng có sẵn 900l dung dịch 1 (triozol), vortex 30s, để yên 10 phút, thêm vào 200l dung dịch 2 (chloroform), trộn đều, để yên 10 phút. Ly tâm 13000 vòng /phút trong 10 phút.
Bước 3: Thu 600l dung dịch nổi có chứa DNA (chỉ thu dịch nổi) vào 1 tube vô trùng khác có sẵn 600l dung dịch 3 (izopropanol) (trộn đều dd3 trước khi sử dụng). Trộn đều dịch trong tube, để yên trong tủ lạnh 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
Bước 4: Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh ( tránh loại bỏ luôn phần cặn), cho từ từ 900l dung dịch 4 (ethanol) vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
Bước 5: Thu cặn màu xanh, để khô ở 600C trong 10-15 phút, cho 50l dung dịch 5 (TE 1X) vào và đặt phản ứng.
Bước 6: Nếu chưa đặt phản ứng phải bảo quản mẫu ở -200C.
Mẫu
QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA/RNA
Vào eppendorf chứa 900 µl dung dịch 1 Ly tâm 13.000 vòng/phút, 10 phút Hút 200 µl µl mẫu (Mẫu bệnh lao hút 100 µl) Vortex Trộn đều Thêm vào 200 µl dung
dịch 2 Hút 600 µl dung dịch nổi vào eppendorf có sẵn 600 µl dung dịch 3 Làm lạnh 10 phút Ly tâm 13.000 vòng/phút, 10 phút Đểyên 10 phút Đổdung dịch nổi Thu cặn màu xanh
Thêm vào 900 µl dung dịch 4 Ly tâm 13.000 vòng/phút, 5 phút Đổdung dịch nổi thu cặn màu xanh Thấm vào giấy cho ráo Sấy khôở60 oC
Cho vào 50 µl dung dịch TE 1X Mẫu lao cho vào 100
µl dung dịch TE 1X
Bảo quản lạnh -20 oC Mẫu RNA cho vào