Sự tạo liên kết ngang là quá trình sử dụng một tác nhân đa chức để tạo cầu nối giữa các nhĩm xúc tác sinh học khác nhau hay protein khác nhau để tạo ra một hợp chất cĩ trọng lượng phân tử lớn rất nhiều và khơng cĩ tính hịa tan.
Cĩ thể tạo liên kết ngang các phân tử của cùng enzym hay cố kết hai hay nhiều protein với nhau (enzym với enzym hay enzym với protein hoặc nhiều enzym trên protein mang chẳng hạn như albumin trong huyết thanh của bị (BSA). Ngay cả cơ quan hay các tế bào cũng cĩ thể kết dính được bằng việc tạo ra các liên kết ngang.
Glutaraldehyde là tác nhân tạo liên kết ngang thường dùng. Tác nhân cĩ hai nhĩm chức aldehyde ở các đầu mạch này sẽ phản ứng với nhĩm amine trên phân tử protein hay enzym và tạo ra các hợp chất mang tính base:
Cũng cĩ thể thay Glutaraldehyde bằng tác nhân hai chức khác như hexamethylene diisocyanate O=C=N-(CH2)6-N=C=O làm tác nhân tạo liên kết ngang. Cĩ 4 phương pháp chính để cố định enzym bằng liên kết ngang:
• Phương pháp ngâm (Immersion method)
Ứng dụng: Phương pháp ngâm này dùng để cố định enzym urease lên điện cực thủy tinh hay điện cực pH-nhạy cảm với các cation hĩa trị I.
Nguyên tắc: Chuẩn bị dung dịch cố định: Lấy 600 đơn vị I.U enzym Urease hịa tan trong 1ml đệm phosphate 0.02M, pH = 6.8. Thêm vào 1 ml dung dịch albumine huyết thanh bị 17.5%, sau đĩ thêm 0.07 ml dung dịch glutaraldehyde 25% để thu được nồng độ cuối cùng 0.8%. Khuấy dung dịch trong 2 phút.
đĩ lau khơ bằng giấy lọc. Nhúng ngập bầu điện cực trong dung dịch cố định trên, xoay điện cực nhẹ nhàng xung quanh trục của điện cực trong 15 phút để tạo một lớp dung dịch cố định đồng nhất. Một vịng “O” được gắn khít vào để giữ cho màng enzym này bám chặt lên bầu điện cực. Sau đĩ rửa điện cực bằng nước cất, dung dịch glycine, và cuối cùng bằng nước cất để tách rửa hay trung hịa tác nhân tạo liên kết ngang.
Hình 3.2: Nguyên tắc của phương pháp ngâm
Ưu điểm: Phương pháp thực hiện đơn giản, thích hợp cho việc cố định các Enzym lên đa số các bộ biến năng, đặc biệt bộ biến năng nhỏ.
• Phương pháp kết hợp trực tiếp (Direct binding method):
Nguyên tắc: Nhỏ 10 µl dung dịch chứa enzym lên trên đỉnh của một điện cực, sau đĩ nhỏ 10µl dung dịch chứa tác nhân tạo liên kết glutaraldehyde.
Phương pháp này cũng được dùng để cố định enzym lên màng kỵ nước của các điện cực cảm ứng khí như màng fluorocarbon hay polytetrafluoroethylene.
Ưu điểm: Tiết kiệm enzym, dùng để cố định các enzym cĩ giá thành cao. • Phương pháp sử dụng bình phun (Use of aerosol):
Nguyên tắc: đầu nhạy cảm của một điện cực được rửa và ngâm trong dung dịch enzym khoảng 20 phút để đảm bảo sự hấp thu enzym lên điện cực enzym. Điện cực này sau đĩ được sấy khơ ở 4oC và xoay. Glutaraldehyde được bơm lên trên điện cực từ một khoảng cách đủ lớn để ngăn cản tạo giọt. Sau khi tạo liên kết ngang, điện cực enzym được rửa với nước, sẵn sàng cho việc sử dụng.
Ưu điểm: bề dày lớp enzym cực kỳ mỏng (1-2µm) và các biosensor tạo ra cĩ thời gian đáp ứng cực ngắn (5-10s).
Ứng dụng: Phương pháp này dùng để cố định enzym pennicilinase, urease và acetylcholinesterase, cố định các protein lên nhiều chất mang.
Các màng membrane tăng cường-gia cố (Re-inforced membranes): Enzym được cố định lên một diện tích rộng của màng nylon bằng những dĩa nhỏ chứa membrane enzym cĩ cùng mẻ và sự cố định giống nhau. Sau đĩ các màng này được kẹp vào trong bộ biến năng. Màng membran tăng cường-gia cố này cĩ phần sợi do đĩ cải thiện tính chất cơ học của màng enzym.
Các màng membrane gắn nhĩm chức sẵn (Prefunctionalized membrane) dùng các màng membrane xốp sẵn cĩ trên thị trường. Những màng này cĩ các nhĩm chức liên kết cĩ khả năng phản ứng với vị trí tự do của enzym. Các màng này sau đĩ đem ngâm trong dung dịch chứa enzym đã chọn để thu được một màng enzym với những tính chất cơ học hữu dụng.
3.1.3. Sự cố định cofactor:
Cofactor được cố định lên chất mang đồng thời cùng lúc với enzym bằng phương pháp hấp thụ vật lý, hay bằng liên kết ngang.
3.2. Cố định Vi sinh vật
Vi sinh vật cĩ kích thước lớn hơn enzym do đĩ dễ dàng cố định bằng phương pháp vật lý. Chúng cĩ thể được cố định bằng gel agar hay polyacrylamide hoặc màng thẩm thấu và màng lọc membrane như millipore 0.22 µm – chế tạo từ ester cellulosic. Tồn bộ tế bào vi sinh vật được cố định trong huyền phù collagen đã được xử lý bởi glutaraldehyde. Màng collagen cũng được sử dụng như một chất mang vật lý.
Màng kỵ nước và vi sinh vật cĩ thể được gắn đồng thời lên các điện cực khuếch tán khí chẳng hạn như điện cực pNH3, pO2, pCO2. Vi sinh vật được nhốt trong các lỗ màng lọc cellulose acetate, sau đĩ rửa các tế bào vi sinh vật tự do trên bề mặt và đặt màng vi sinh vật trên vào điện cực dùng màng thẩm thấu và ngâm trong dung dịch đệm để loại bỏ các thành phần dinh dưỡng ảnh hưởng tới phép đo. Các điện cực vi sinh vật được bảo quản ở nhiệt độ 40C trong dung dịch đệm phosphate.
Cũng cĩ thể cố định một enzym và một tế bào vi sinh vật lên cùng bộ biến năng. Vi sinh vât được cố định bằng phương pháp vật lý và enzym được cố định bằng phương pháp liên kết đồng hĩa trị để tránh sự nhả protein.
Vi khuẩn acetic thuộc lồi Acetobacter xylinum cĩ khả năng tạo ra màng mỏng trong mơi trường tĩnh sau khi xử lý với glutaraldehyde và cĩ những tính chất cơ học nhất định thì cĩ thể cố định trực tiếp vào điện cực Oxy mà khơng cần dùng màng thẩm thấu.
3.3.2. Cố định các tác nhân miễn dịch:
Nhiều điện cực miễn dịch được tạo ra bằng các cố định các tác nhân miễn dịch lên các bộ biến năng khác nhau.