Trong phân tích Asen tùy theo điều kiện hiện trƣờng mà lựa chọn phƣơng pháp phân tích phù hợp.
1.5.1. Phương pháp đo hiện trường với chất nhuộm thủy ngân Bromua
+Nguyên tắc: Asen(III) và Asen(V) đƣợc chuyển thành khí AsH3 nhờ hỗn hợp khử mạnh : NH2SO3H- axit sunfamic và NaBH4 - (Natri bohiđrua). Khí Asin tạo thành sẽ tạo phức với thủy ngân bromua đƣợc tẩm trên giấy và chuyển thành màu vàng. Việc định lƣợng dựa vào màu trên giấy thử hoặc độ đậm nhạt của màu.
+ Giới hạn phát hiện: 10ppb.Tuy nhiên, độ hấp thụ quang có thể bị ảnh hƣởng bởi khí H2S, Cần dùng bông lọc chứa chì axetat để hấp thụ khí này.
+ Ứng dụng: Đo hiện trƣờng với số lƣợng mẫu lớn, chủ yếu cho mục đích sàng lọc trên diện rộng.[13]
1.5.2. Phương pháp phổ phát xạ nguyên tử cảm ứng cộng hưởng plasma (ICP- ASE)
+ Nguyên tắc: Dung dịch mẫu đƣợc phun ở dạng sol tới vùng plasma agon có nhiệt độ từ 60000
K đến 80000K, tại đó , Asen đƣợc nguyên tử hóa và phát xạ bƣớc sóng đặc trƣng. Nồng độ Asen trong mẫu đƣợc xác định dựa trên cƣờng độ của các vạch phát xạ.
+ Giới hạn phát hiện: 35 -50 ppb.
+ Ứng dụng: Phƣơng pháp này có thể xác định nhiều nguyên tố cùng một lúc và đƣợc áp dụng đối với tất cả các loại nền màu khác nhau, tuy nhiên, các mẫu rắn và mẫu lỏng chứa nhiều kết tủa phải xử lý trƣớc khi phân tích.
1.5.3. Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử kết hợp thiết bị sinh khí Hiđrua ( HVG - ASS) .
Quang phổ hấp thụ nguyên tử (ASS) là một kỹ thuật phân tích lƣợng vết các nguyên tố phổ biến, đƣợc sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm với độ chọn lọc độ lặp lại cao, có thể phân tích hàng loạt mẫu trong thời gian ngắn, giá thành thiết bị không quá đắt. Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng rộng rãi trong phân tích định lƣợng Asen kết hợp với thiết bị tạo khí Hiđrua.
+ Nguyên tắc: Asen vô cơ hòa tan trong nƣớc có thể ở dạng As(III) hay As(V), hiệu suất tạo khí Hiđrua của hai dạng này khác nhau nên tất cả các Asen trong mẫu phải đƣợc khử về As(III) nhờ tác nhân khử của KI hoặc NaI. Sau đó As(III) phản ứng với hiđro mới sinh (tạo thành khi tác nhân khử Zn hoặc NaBH4 gặp môi trƣờng axit) tạo ra hợp chất Asin - AsH3. Khí Asin sẽ
đƣợc dẫn vào bộ phận nguyên tử hóa mẫu nhờ khí Argon tạo ra các đám hơi nguyên tử tự do. Các nguyên tử này sẽ hấp thụ các tia sáng có bƣớc sóng đặc trƣng và cho kết quả độ hấp thụ.[13]
+ Giới hạn phát hiện: Phƣơng pháp này có thể xác định hàm lƣợng Asen trong mẫu cỡ 0,5ppb.
1.5.4. Phương pháp dùng vi khuẩn phát sáng.
Nhóm nghiên cứu thuộc Viện khoa học và Công nghệ môi trƣờng Thụy Sĩ đã lợi đụng khả năng nhạy cảm với Asen của vi khuẩn Escherichia coli để biến đổi gen sao cho chúng phát sáng khi dò thấy Asen trong nƣớc.
E. Coli hiện đang đƣợc thử nghiệm tại Việt Nam, có ƣu điểm vƣợt trội so với các phƣơng pháp khác là chi phí thấp mà không giải phóng các hóa chất độc hại vào môi trƣờng.
1.5.5. Phương pháp phân tích thể tích
Dùng dung dịch chuẩn I2 + KI chuẩn dung dịch Asenic (AsO33-) trong môi trƣờng kiềm có thêm vài giọt hồ tinh bột. Tại điểm cuối của phép chuẩn độ dung dịch có mau xanh hồ tinh bột + iôt. Để đảm bảo độ chính xác của phép chuẩn độ cần đƣa mọi dạng tồn tai của Asen về As(III).
I2 + AsO33- + 2OH- AsO43- + 2I- + H2O
1.5.6. Phương pháp cực phổ Von- Ampe hòa tan
Cơ sở của phƣơng pháp Von- Ampe hòa tan là xây dựng đƣờng cong phụ thuộc giữa cƣờng độ dòng điện và hiệu điện thế giữa hai điện cực đƣợc đặt trong bình điện phân chứa chất cần nghiên cứu. Phƣơng pháp Von- Ampe hòa tan gồm có các giai đoạn chính nhƣ sau:
Khi điện phân làm giàu cần chọn thế thích hợp và giữ không đổi trong suốt quá trình điện phân. Thông thƣờng ngƣời ta chọn thế ứng với dòng khuyếch tán giới hạn của chất cần phân tích và tại thế đó chỉ có một số tối thiểu các chất bị oxi hóa hoặc khử trên điện cực.
Các loại phản ứng có thể dùng để kết tủa lên bề mặt điện cực có thể là: - Khử ion kim loại trên điện cực thủy ngân
Men+ + ne + Hg Me(Hg) - Khử ion kim loại trên điện cực rắn trơ Men+ + ne Me
- Phản ứng làm giàu chất điện cực dƣới dạng hợp chất khó tan hoặc với ion kim loại dùng làm điện cực hoặc với một ion nào đó trong dung dịch. - Hấp thụ điện hóa các chất lên bề mặt điện cực làm việc bằng cách thêm vào dung dịch một thuốc thử có khả năng bị hấp phụ lên bề mặt điện cực, sau khi bị hấp phụ nó sẽ tạo phức với ion cần xác định để tập trung ion đó lên bề mặt điện cực.
Phƣơng pháp Von- Ampe hòa tan đƣợc phân chia thành dạng Von- Ampe hòa tan anot và Von- Ampe hòa tan catot.
Nếu điện phân là quá trình khử catot ở thế không đổi ETL thì khi hòa tan cho quét thế với tốc độ không đổi, đủ lớn từ giá trị ETL về phía dƣơng hơn. Quá trình hòa tan là quá trình anot và phƣơng pháp gọi là "Von- Ampe hòa tan anot" hay viết tắt là ASV (Anodic Stripping Vontammestry).
Nếu điện phân là quá trình oxi hóa anot ở thế không đổi ETL thì khi hòa tan cho quét thế với tốc độ không đổi, đủ lớn từ giá trị ETL về phía thế âm hơn. Quá trình hòa tan là quá trình catot và phƣơng pháp gọi là "Von- Ampe hòa tan catot" hay viết tắt là CSV (Catotdic Stripping Vontammestry).
1.5.8. Phương pháp trắc quang [4,5,10]
Nguyên tắc : Để quan sát đƣợc phổ hấp thụ trong vùng UV - VIS ta phải có chất nghiên cứu ở dạng có màu. Các chất xác định cần chuyển vào dung dịch dƣới dạng hợp chất màu với một thuốc thử thích hợp có độ nhạy lớn trong vùng phổ UV - VIS trong các điều kiện tối ƣu ( pH, nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ thuốc thử...).
Chụp phổ hấp thụ electron của hợp chất màu ở dải sóng 200 - 1000 nm. Tại điểm độ hấp thụ quang đạt giá trị cực đại ta tìm đƣợc bƣớc sóng mà chất màu hấp thụ ánh sáng cực đại.
Khả năng hấp thụ ánh sáng của dung dịch màu đƣợc xác định bởi biểu thức định lƣợng của định luật Buger - Lambe - Beer:
A = .l.C Trong đó:
A: Mật độ quang - Khả năng hấp thụ ánh sáng của dung dịch màu. : Hệ số hấp thụ phân tử mol.
l: Bề dày cuvet có đơn vị cm. C: Nồng độ của dung dịch màu.
Trong thực hành phân tích trắc quang, ngƣời ta thƣờng xây dựng đƣờng cong biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ chất màu trong dung dịch:
A = f(C).
Thực nghiệm cho thấy, mật độ quang chỉ phụ thuộc tuyến tính theo nồng độ ở một giới hạn C0 nhất định. Do đó, ta thƣờng xác định nồng độ chất nghiên cứu trong mẫu ở khoảng nồng độ tuyến tính OA (hình 1.1), nếu nồng độ lớn hơn C0thì ta phải pha loãng mẫu, kết quả nhân với hệ số pha loãng.
C0 C(mg/l)
Hình 1.1. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ chất hấp thụ.
0
A0
A
Phƣơng pháp đƣờng chuẩn trong phân tích trắc quang:
Trong thực tế ngƣời ta chỉ sử dụng vùng tuyến tính (Đoạn OA hay còn gọi là đƣờng chuẩn), khoảng tuyến tính này rộng hay hẹp tùy thuộc vào độ nhạy của hợp chất màu. Các chất càng nhạy trong vùng phổ UV - VIS thì vùng tuyến tính càng hẹp và lùi về phía nồng độ thấp, thuận lợi cho việc định lƣợng vết chất.
Các bước xây dụng đường chuẩn:
Phƣơng pháp này dựa trên cơ sở xây dựng đƣờng chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính của mật độ quang vào nồng độ, sau đó đo mẫu trong cùng điều kiện, từ đó xác định đƣợc hàm lƣợng chất cần phân tích dựa vào đƣờng chuẩn.
Phƣơng pháp này bao gồm các bƣớc nhƣ sau:
Bƣớc 1: Chụp phổ hấp thụ phân tử của thuốc thử và hợp chất màu.
Bƣớc 2: Khảo sát, chọn các điều kiệ tối ƣu cho sự tạo hợp chất màu nhƣ: thời gian, độ pH, tỉ lệ thuốc thử...
Bƣớc 3: Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn chứa chất cần phân tích với hàm lƣơng tăng dần, cho vào mỗi dung dịch một lƣợng thuốc thử nhƣ nhau, các điều kiện để tạo phức nhƣ: pH, thời gian, nhiệt độ và các điều kiện khác nhƣ nhau. Sau đó, xác định mật độ quang của hợp chất màu trong khoảng nồng độ tuyến tính.
Bƣớc 4: Từ giá trị mật độ quang và nồng độ, ta thiết lập đƣợc đƣờng chuẩn trong hệ tọa độ xy, xác định đƣợc hàm lƣợng chất cần nghiên cứu trong mẫu thực(Cx) bằng đƣờng chuẩn khi biết giá trị mật độ quang của mẫu(Ax).
Phương pháp trắc quang với phép phân tích Asen
Trong phép phân tích Asen bằng phƣơng pháp trắc quang, nhiều công trình nghiên cứu đã sử dụng nhiều loại thuốc thử, trong phạm vi của luận văn này chúng tôi sử dụng thuốc thử là Bạc đietylđithiocacbamat để tạo phức với
khí Asin - AsH3, đây là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến nhất để phân tích Asen bằng phƣơng pháp trắc quang. Qui trình của phƣơng pháp có thể tóm tắt nhƣ sau:
Nguyên tắc: Các hợp chất của Asen trong mẫu đƣợc oxi hóa bằng KMnO4 hoặc K2S2O8, tiếp theo As(v) đƣợc khử về As(III) bằng KI. Sau đó Asen đƣợc khử tiếp thành khí Asin - AsH3 bằng hiđro mới sinh trong môi trƣờng axit. Asin tác dụng với dung dịch Bạc đietylđithiocacbamat trong piriđin hoặc clorofom tạo phức màu đỏ tím. Sau đó, đo độ hấp thụ quang của phức màu đƣợc tạo thành ở bƣớc sóng 520nm.
CHƢƠNG II
THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
2.1.1. Thiết bị và dụng cụ
- Máy đo quang: GBC Cintra 40 UV - Visible spectrometer. - Máy đo pH: TOA pH METTER MODEL HM 5BS của Nhật. - Máy đông khô.
- Máy cất nƣớc hai lần: MILL_ Q của Thụy Sĩ.
- Cân phân tích chính xác 0,01mg: Srtocius - Thụy Sĩ. - Tủ sấy, lò nung, tủ hút, bếp khuấy từ.
- Máy li tâm, bể rung siêu âm.
- Bình định mức: 500ml, 250ml, 100ml, 50ml,25ml. - Cốc thủy tinh: 500ml, 250ml, 100ml, 50ml.
- Pipet các loại: 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml. - Đũa thủy tinh, giấy lọc, bình tia.
- Phễu lọc, giấy siêu lọc, các bình PVE, chai thủy tinh tối màu.... - Dụng cụ thí nghiệm bằng teflon, thạch anh....
- Hệ tạo phức của Asen với thuốc thử Bạc đietylđithiocacbamat. - Bình đựng mẫu...
Tất cả các dụng cụ dùng để phân tích đều đƣợc ngâm bằng HNO3 10% trong 24 giờ, sau đó đƣợc rửa sạch và tráng bằng nƣớc cất hai lần.
2.1.2. Hóa chất
- Axit HNO3. - Axit H2SO4 - Axit HCl.
- Dung dịch chuẩn Asen 1000 ppm. - Thuốc thử Bạc đietylđithiocacbamat. - Methalnol - CH3OH.
-Mẫu cá chuẩn Dogfish Liver Certified Reference Material for Trace Metals (DOLT-3) có hàm lƣợng Asen tổng số: 10,20,5(mg/kg)
2.1.3. Chuẩn bị hóa chất và dung dịch chuẩn.
+ Dung dịch chuẩn asen 10 mg/l
Lấy 1ml dung dịch chuẩn gốc asen 1000 mg/l cho vào bình 100ml định mức đến vạch bằng nƣớc cất hai lần.
+ Dung dịch chuẩn Asen 100g/l:
Lấy chính xác 1ml dung dịch chuẩn làm việc 10ppm cho vào bình 100ml định mức đến vạch bằng nƣớc cất hai lần.
+ Dung dịch Axit dimetylasinic-DMA mg/l: Cân 28,57mg ( CH3)2AsNaO2.3H2O thêm nƣớc cất, định mức đến 100ml.
+ HNO3 : HClO4 (1: 1): Trộn 100ml HNO3 ? với 100ml HClO4 72%. + MeOH : H2O (1 : 1): Trộn 150ml MeOH với 150ml nƣớc cất hai lần.
+ Axit HCl 15%:
Hút 101,2 ml HCl 37% cho vào định mức đến 250 ml bằng nƣớc cất đƣợc 250ml dung dịch HCl 15%.
+ Thuốc thử Bạc đietylđithiocacbamat:
Pha loãng 1ml Mocfolin trong 70ml Clorofom thêm 0,3 g Bạc đietylđithiocacbamat, lắc nhẹ cho đến khi Bạc đietylđithiocacbamat tan hoàn toàn, sau đó định mức đến vạch bằng Clorofom. Dung dịch pha đƣợc có màu vàng, đƣợc bảo quản trong điều kiện không tiếp xúc với ánh sáng.
+Pha natri bo hiđrua (NaBH4):
Hòa tan 0,4 gam NaOH trong 400ml nƣớc, sau đó thêm 4gam Natri bo hiđrua (NaBH4) vào dung dịch trên, lắc nhẹ cho NaBH4 tan hoàn toàn (dung dịch này chuẩn bị hàng ngày).
+Axit clohiđric HCl 2M:
Pha loãng 165ml Axit clohiđric đặc đến thể tích V = 1 lit bằng nƣớc cất hai lần.
+ Dung dịch Chì axetat:
Hòa tan 10 gam (CH3COO)2Pb.2H2O trong 100ml nƣớc cất hai lần.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu:
2.2.1.Phương pháp xác định asen :
Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật hydrua là một trong những phƣơng pháp phổ biến nhất đƣợc sử dụng để phân tích asen, do giá thành thiết bị cao, cùng với quy trình vận hành phức tạp, nên chỉ có ít phòng thí nghiệm ở Việt Nam sử dụng phƣơng pháp này để xác định asen. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định hàm lƣợng asen trong các mẫu hải sản bằng phƣơng pháp trắc quang.
Nguyên tắc của phƣơng pháp đƣợc tóm tắt nhƣ sau: Các dạng asen vô cơ hòa tan trong dung dịch, có thể ở dạng As (III) hoặc As (V) đƣợc khử về dạng As(III) bằng dung dịch KI vì hiệu suất tạo hydrua của As(V) thấp hơn nhiều so với As(III). Dạng asen này sẽ phản ứng với hidro mới sinh tạo thành khí (AsH3) bởi NaBH4 hoặc kẽm hạt trong môi trƣờng axit (pH=1). Khí Asin giải phóng đƣợc hấp thụ trong dung dịch bạc đietylđithiocarbamat, tạo thành hợp chất màu đỏ tím có cực đại hấp thụ tại bƣớc sóng 520 nm.
AsO4 3- + 2I- + 2H+ AsO3 3- + I2+ H2O 3Zn + As3+ + 3H+ 3Zn2+ + AsH3
Sơ đồ của: Hệ tạo hợp chất mầu của Asin và Bạc đietylđithiocarbamatnhƣ sau.
- Phân tích asen tổng số: Để phân tích hàm lƣợng tổng asen trong hải sản, mẫu đƣợc vô cơ hóa bằng hỗn hợp các axit để chuyển tất cả các dạng asen về asen (V), sau đó asen (V) đƣợc khử về asen (III) bằng KI và xác định bằng phƣơng pháp đo quang.
- Phân tích các dạng asen vô cơ: Mẫu hải sản đƣợc chiết trong hỗn hợp methanol- nƣớc bằng siêu âm, sau đó ly tâm và xác định hàm lƣợng tổng asen vô cơ trong dịch chiết bằng phƣơng pháp đo quang.
- Phân tích các dạng asen hữu cơ: Hàm lƣợng asen hữu cơ đƣợc tính toán dựa trên hàm lƣợng asen tổng số và hàm lƣợng asen vô cơ
2.2.2. Phương pháp xử lý mẫu:
- Phân tích asen tổng số:
Trong mẫu hải sản, asen đƣợc liên kết chặt chẽ với các protein. Do đó
trƣớc khi định lƣợng, cần phá vỡ nền protein của mẫu để đƣa các dạng asen về dạng vô cơ bằng một phƣơng pháp vô cơ hóa thích hợp. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật vô cơ hóa ƣớt có sử dụng hỗn hợp các axit HNO3, HClO4 và H2SO4 theo các tỷ lệ thích hợp.
- Phân tích asen vô cơ:
Để phân tích hàm lƣợng tổng asen vô cơ trong các mẫu hải sản, chúng tôi sử dụng quy trình chiết của Nguyễn Đình Thuất[13], mẫu đƣợc chiết với MeOH-H2O bằng siêu âm, sau đó ly tâm và tiến hành phân tích bằng phƣơng pháp trắc quang.
2.3. Đối tƣợng nghiên cứu:
Asen là nguyên tố độc hại, có khả năng tích lũy sinh học cao, đặc biệt là trong các đối tƣợng thủy hải sản, tuy nhiên mức độ độc hại của asen lại phụ thuộc vào dạng hóa học của chúng. Do vậy đối tƣợng nghiên cứu của luận văn này là sự tích lũy và phân bố các dạng asen vô cơ và hữu cơ trong các loại hải sản bao gồm: Tôm, cá ngừ, cá thu, cá khoai, cá ngân, sao biển, vẹm xanh, ngao..
2.4. Nội dung nghiên cứu.
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu xác định hàm lƣợng Asen tổng số, dạng hợp chất Asen vô cơ, dạng hợp chất Asen hữu cơ trong các mẫu hải sản trên với nội dung nhƣ sau:
2.4.1. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để xác định asen bằng phương pháp đo quang:
- Khảo sát sự hình thành hợp chất mầu của asin với thuốc thử