2.2.1.Phương pháp xác định asen :
Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật hydrua là một trong những phƣơng pháp phổ biến nhất đƣợc sử dụng để phân tích asen, do giá thành thiết bị cao, cùng với quy trình vận hành phức tạp, nên chỉ có ít phòng thí nghiệm ở Việt Nam sử dụng phƣơng pháp này để xác định asen. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định hàm lƣợng asen trong các mẫu hải sản bằng phƣơng pháp trắc quang.
Nguyên tắc của phƣơng pháp đƣợc tóm tắt nhƣ sau: Các dạng asen vô cơ hòa tan trong dung dịch, có thể ở dạng As (III) hoặc As (V) đƣợc khử về dạng As(III) bằng dung dịch KI vì hiệu suất tạo hydrua của As(V) thấp hơn nhiều so với As(III). Dạng asen này sẽ phản ứng với hidro mới sinh tạo thành khí (AsH3) bởi NaBH4 hoặc kẽm hạt trong môi trƣờng axit (pH=1). Khí Asin giải phóng đƣợc hấp thụ trong dung dịch bạc đietylđithiocarbamat, tạo thành hợp chất màu đỏ tím có cực đại hấp thụ tại bƣớc sóng 520 nm.
AsO4 3- + 2I- + 2H+ AsO3 3- + I2+ H2O 3Zn + As3+ + 3H+ 3Zn2+ + AsH3
Sơ đồ của: Hệ tạo hợp chất mầu của Asin và Bạc đietylđithiocarbamatnhƣ sau.
- Phân tích asen tổng số: Để phân tích hàm lƣợng tổng asen trong hải sản, mẫu đƣợc vô cơ hóa bằng hỗn hợp các axit để chuyển tất cả các dạng asen về asen (V), sau đó asen (V) đƣợc khử về asen (III) bằng KI và xác định bằng phƣơng pháp đo quang.
- Phân tích các dạng asen vô cơ: Mẫu hải sản đƣợc chiết trong hỗn hợp methanol- nƣớc bằng siêu âm, sau đó ly tâm và xác định hàm lƣợng tổng asen vô cơ trong dịch chiết bằng phƣơng pháp đo quang.
- Phân tích các dạng asen hữu cơ: Hàm lƣợng asen hữu cơ đƣợc tính toán dựa trên hàm lƣợng asen tổng số và hàm lƣợng asen vô cơ
2.2.2. Phương pháp xử lý mẫu:
- Phân tích asen tổng số:
Trong mẫu hải sản, asen đƣợc liên kết chặt chẽ với các protein. Do đó
trƣớc khi định lƣợng, cần phá vỡ nền protein của mẫu để đƣa các dạng asen về dạng vô cơ bằng một phƣơng pháp vô cơ hóa thích hợp. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật vô cơ hóa ƣớt có sử dụng hỗn hợp các axit HNO3, HClO4 và H2SO4 theo các tỷ lệ thích hợp.
- Phân tích asen vô cơ:
Để phân tích hàm lƣợng tổng asen vô cơ trong các mẫu hải sản, chúng tôi sử dụng quy trình chiết của Nguyễn Đình Thuất[13], mẫu đƣợc chiết với MeOH-H2O bằng siêu âm, sau đó ly tâm và tiến hành phân tích bằng phƣơng pháp trắc quang.
2.3. Đối tƣợng nghiên cứu:
Asen là nguyên tố độc hại, có khả năng tích lũy sinh học cao, đặc biệt là trong các đối tƣợng thủy hải sản, tuy nhiên mức độ độc hại của asen lại phụ thuộc vào dạng hóa học của chúng. Do vậy đối tƣợng nghiên cứu của luận văn này là sự tích lũy và phân bố các dạng asen vô cơ và hữu cơ trong các loại hải sản bao gồm: Tôm, cá ngừ, cá thu, cá khoai, cá ngân, sao biển, vẹm xanh, ngao..
2.4. Nội dung nghiên cứu.
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu xác định hàm lƣợng Asen tổng số, dạng hợp chất Asen vô cơ, dạng hợp chất Asen hữu cơ trong các mẫu hải sản trên với nội dung nhƣ sau:
2.4.1. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để xác định asen bằng phương pháp đo quang:
- Khảo sát sự hình thành hợp chất mầu của asin với thuốc thử - Khảo sát cực đại hấp thụ của hợp chất màu.
- Khảo sát thời gian phản ứng.
- Khảo sát ảnh hƣởng của thể tích mẫu, thể tích thuốc thử. - Xây dựng đƣờng chuẩn để xác định Asen.
2.4.2. Xây dựng qui trình phân tích cho các đối tượng mẫu nghiên cứu.
- Nghiên cứu, khảo sát và lựa chọn phƣơng pháp xử lý mẫu thích hợp để định lƣợng Asen.
- Nghiên cứu, khảo sát ảnh hƣởng của các loại axit và nồng độ axit đến qui trình xử lý mẫu.
- Xác định qui trình phân tích Asen tổng số, qui trình phân tích dạng Asen hữu cơ và vô cơ trong các mẫu hải sản.
- Phân tích định lƣợng Asen tổng số, xác định hàm lƣợng các dạng Asen hữu cơ và vô cơ trong các mẫu hải sản theo qui trình đã xây dựng và xác định đƣợc.
- Xử lý và đánh giá kết quả thực nghiệm.
- Kết luận về tính độc của các hải sản đã phân tích.
2.5. Lấy mẫu và bảo quản mẫu.
- Các mẫu cá, tôm sú, vẹm xanh, sao biển, ngao trƣớc khi phân tích đƣợc rửa sạch bằng nƣớc cất hai lần, cất vào tủ đông cho đến khi đông đá hoàn toàn, sau đó, mẫu đƣợc làm khô bằng phƣơng pháp đông khô chân không để không phá vỡ cấu trúc ban đầu của mẫu, giữ nguyên đƣợc dạng hữu cơ trong mẫu. Cuối cùng, nghiền nhỏ mẫu và bảo quản ở nhiệt độ -50C.
Hình 2.1: Quy trình xác định tổng số, tổng dạng Asen trong một số hải sản bằng phương pháp trắc quang
Mẫu hải sản dạng bột
Asen tổng số Dạng Asen vô cơ
cơ
Dạng Asen hữu cơ Mẫu đã vô cơ
hóa (dạng dung dịch) Mẫu chiết (dạng dung dịch) Mẫu hải sản
CHƢƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát các điều kiện tối ƣu cho quá trình tạo hợp chất màu
Để nghiên cứu sự tạo thành hợp chất màu của bạc Đietylđithiocacbamat với khí Asin- AsH3 bằng phƣơng pháp trắc quang, trƣớc hết phải biết đƣợc phổ hấp thụ của thuốc thử và của phức. Vì vậy, công việc đầu tiên là khảo sát phổ của chúng.
3.1.1. Khảo sát phổ hấp thụ của thuốc thử:
Dùng pipet lấy chính xác 10ml dung dịch HCl 15% vào bình phản ứng, thêm 4g Zn, đồng thời lắp bình hấp thụ của hệ tạo phức đã có sẵn 4ml dung dịch bạc Đietylđithiocacbamat vào bình phản ứng, khuấy từ ở bình phản ứng trong thời gian 20 phút, để yên 10 phút.. Sau đó đem đo mật độ quang của dung dịch thuốc thử với cuvet 1cm ở dải sóng 350nm-750nm. Dung dịch so sánh là Clorofom.
Kết quả đo đƣợc biểu diễn trên hình 3.1.
3.1.2. Khảo sát phổ hấp thụ của hợp chất màu
- Lấy 50 ml dung dịch Asen(III) 50g/l vào bình phản ứng của hệ tạohợp chất màu, thêm 1ml dung dịch KI 10%, 10ml dung dịch HCl 15% , và 4g Zn, đồng thời lắp bình hấp thụ của hệ tạo phức đã có sẵn 4ml dung dịch bạc Đietylđithiocacbamat vào bình phản ứng. Khuấy từ ở bình phản ứng trong thời gian 20 phút. Dạng asen này phản ứng với hidro mới sinh tạo thành khí (AsH3) trong môi trƣờng axit (pH=1). Khí Asin giải phóng đƣợc hấp thụ trong dung dịch bạc đietylđithiocarbamat tạo hợp chất màu, sau đó, lấy phần hợp chất màu vừa tạo đƣợc đem đo phổ ở dải sóng 350nm - 750nm, với dung dịch so sánh là Clorofom, ta thu đƣợc phổ hấp thụ của hợp chất màu nghiên cứu ở hình 3.1.
Hình 3.1. Phổ hấp thụ của thuốc thử và phổ hấp thụ của hợp chất màu của Asen
- Dựa vào phổ hấp thụ của thuốc thử và phổ hấp thụ của phức màu của Asen
cho thấy hợp chất màu có đỉnh hấp thụ đạt cực đại tại bƣớc sóng λmax= 520nm. Cũng tại bƣớc sóng này thuốc thử Bạc đietylđithiocacbamat và dung dịch clorofomkhông có đỉnh hấp thụ, vì vậy, để đảm bảo độ chính xác và độ nhạy của phép phân tích, chúng tôi chọn bƣớc sóng λ= 520nm, khi khảo sát mật độ quang trong các phép đo về sau.
Dung dịch so sánh đƣợc sử dụng trong các phép đo là Clorofom vì tuy thuốc thử Bạc đietylđithiocacbamat có màu, song vì thuốc thử Bạc đietylđithiocacbamat và dung dịch clorofom đều không có đỉnh hấp thụ tại bƣớc sóng 520nm. Vì thế, trong các phép đo về sau chúng tôi sử dụng dung dịch so sánh là clorofom.
3.1.3. Khảo sát thời gian tối ưu cho việc tạo hợp chất màu.
Để xét đến khoảng thời gian nào thì phức có độ quang ổn định, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của thời gian tới sự tạo hợp chất màu nhƣ sau: - Lấy 50 ml dung dịch Asen(III) 50g/l vào bình phản ứng của hệ tạo Asin, thêm 1ml dung dịch KI 10%, 10ml dung dịch HCl 15% , và 4g Zn, đồng thời lắp bình hấp thụ đã có sẵn 4ml dung dịch bạc Đietylđithiocacbamat vào bình phản ứng. Khuấy từ ở bình phản ứng với thời gian thay đổi nhƣ trong bảng 3.1 tạo ra hơi Asin, hơi Asin giải phóng ra đƣợc dẫn vào bình hấp thụ của hệ tạo phức và phản ứng với 4ml dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat trong bình hấp thụ tạo hợp chất màu, tiếp theo, đo mật độ quang của hợp chất màu thu đƣợc ở các thời gian trên tại bƣớc sóng 520nm với dung dịch so sánh là clorofom, kết quả thu đƣợc trong bảng 3.1 và đƣợc biểu diễn trên hình 3.2.
Bảng 3.1: Sự phụ thuộc của mật độ quang vào thời gian
Thời gian Mật độ quang(A)
0 0,001
5 0,112
20 0,368
25 0,370
30 0,371
60 0,369
Sự phụ thuộc của mật độ quang vào thời gian 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0 5 10 20 25 30 60 Thời gian (phút) A b s Mật độ quang( A) Hình 3.2
Ảnh hƣởng của thời gian đến độ hấp thụ quang của hợp chất màu
Dựa vào kết quả thu đƣợc trên bảng 3.1 và đồ thị hình 3.2 cho thấy mật độ quang tăng dần trong 20 phút đầu tiên, sau 20 phút mật độ quang ổn định và hầu nhƣ không thay đổi. Nhƣ vậy, hợp chất màu ổn định sau 20 phút và bền trong thời gian dài, do đó chúng tôi chọn thời gian tối ƣu để khảo sát mật độ quang sau khi tạo phức là 20 phút.
3.1.4.Ảnh hưởng của pH đến quá trình khử Asen(III) thành Asin
Theo những kết quả nghiên cứu khảo sát và thu thập các tài liệu tham khảo [15,16] về phƣơng pháp phân tích Asen bằng phƣơng pháp đo quang
cho thấy quá trình khử Asen vô cơ về AsH3 đạt hiệu suất cao nhất tại môi trƣờng Axit có pH = 1. Do đó chúng tôi chọn pH tối ƣu để khảo sát mật độ quang trong quá trình nghiên cứu và phân tích Asen là pH=1 để toàn bộ lƣợng As(III) và As(V) đều đƣợc khử thành Asin.
3.1.5. Ảnh hưởng của nồng độ chất khử (KI) tới độ hấp thụ quang(A) cúa hợp chất màu.
Để phân tích hàm lƣợng Asen tổng số trong các mẫu hải sản thì mẫu phải đƣợc vô cơ hóa với hỗn hợp Axit. Các dạng Asen trong mẫu bị oxi hóa và tồn tại ở dạng As(V). Động học của phản ứng tạo hiđrua(AsH3) của As(V) rất chậm so với As(III), do đó cần khử As(V) về As(III) trƣớc khi tiến hành định lƣợng. Tác nhân khử As(V) về As(III) đã đƣợc nhiều tác giả nghiên cứu[15,16] cho thấy hiệu suất khử As(V) về As(III) đạt 100% khi sử dụng 1ml dung dịch KI 10% cho 50ml dung dịch, do vậy, trong các nghiên cứu tiếp theo trƣớc khi thực hiện phản ứng tạo Asin thì mẫu đƣợc thêm 1ml dung dịch KI 10%.
3.1.6. Ảnh hưởng của nồng độ chất khử (Zn )tới độ hấp thụ quang(A) cúa hợp chất màu.
Qua tham khảo một số tài liệu, xác định Asen bằng phƣơng pháp trắc quang ngƣời ta thƣờng sử dụng hai loại chất khử là: Natribohidrua (NaBH4) và Kẽm (Zn).Việc sử dụng NaBH4 đƣợc ứng dụng nhiều trong phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật hóa hơi lạnh, do phản ứng khử của NaBH4 diễn ra nhanh nên đáp ứng đƣợc thời gian đo phổ hấp thụ nguyên tử của Asen. Đối với kẽm, phản ứng khử các dạng Asen vô cơ về Asin diễn ra chậm hơn nên ít đƣợc sử dụng trong phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử. Tuy nhiên, đối với phƣơng pháp phân tích trắc quang do cần thời gian phản ứng dài để quá trình tạo hợp chất màu đƣợc triệt để, nên kẽm thƣờng đƣợc sử dụng trong phƣơng pháp đo quang. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kẽm là chất khử để khử As(III) thành Asin khi tiến hành xây dựng
đƣờng chuẩn cũng nhƣ phân tích xác định Asen trong mẫu hải sản. Để khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ chất khử Zn đến quá trình tạo hợp chất màu chúng tôi tiến hành thí nghiệm với dãy mẫu chuẩn As(III) có cùng nồng độ là 20g/l trong nền 1ml dung dịch KI 10%, 10ml dung dịch HCl 15% , và lƣợng Zn thay đổi nhƣ trong bảng. Khuấy từ ở bình phản ứng trong thời gian 20 phút tạo ra hơi Asin, hơi Asin đƣợc dẫn vào bình hấp thụ của hệ tạo phức và với phản ứng 4ml dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat tạo hợp chất màu, sau đó, đo mật độ quang của hợp chất màu tại bƣớc sóng 520nm với dung dịch so sánh là clorofom. Các kết quả khảo sát đƣợc đƣa ra trong bảng 3.2 và đƣợc biểu diễn trên hình 3.3.
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ chất khử (Zn )tới độ hấp thụ quang(A) cúa hợp chất màu. STT Lƣợng Zn(g) Độ hấp thụ(A) 1 0 0,002 2 0, 1 0,045 3 0,5 0,075 4 1 0,135 5 2 0,179 6 3 0,181 7 4 0,181 8 5 0,179 9 6 0,184 10 8 0,180
Ảnh hưởng của nồng độ chất khử (Zn) tới độ hấp thụ quang (A) cuả hợp chất màu
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0 0, 1 0,5 1 2 3 4 5 6 8 Lượng Zn(g) A b s Độ hấp thụ(A)
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất khử(Zn)tới độ hấp thụ quang(A)
cúa hợp chất màu.
Dựa vào kết quả thu đƣợc trên bảng 3.2 và đồ thị hình 3.3. cho thấy: Mật độ quang tăng khi tăng lƣợng chất khử (Zn) từ 0,1-2 gam. Khi tiếp tục tăng lƣợng chất khử đến 2g thì mật độ quang ổn định và hầu nhƣ không thay đổi. Nhƣ vậy, độ hấp thụ quang của hợp chất màu ổn định và bền khi lƣợng chất khử từ 2gam trở lên. Tuy nhiên, khi tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn cũng nhƣ khi phân tích mẫu nồng độ của Asen có thể cao hơn, do đó, chúng tôi chọn lƣợng chất khử để tạo phức màu của Asen là 4gam trong tất cả các phép đo về sau.
3.2. Ảnh hƣởng của các yếu tố khác tới sự tạo hợp chất màu
Ngoài thời gian và lƣợng chất khử còn rất nhiều yếu tố khác ảnh hƣởng đến độ hấp thụ quang của hợp chất màu nhƣ: Ảnh hƣởng của thể tích thuốc
thử, thể tích mẫu, ảnh hƣởng của các ion cản... Vì vậy, để thu đƣợc kết quả tin cậy, tiếp theo, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm khảo sát sự ảnh hƣởng của các yếu tố này.
3.2.1.Khảo sát ảnh hưởng của thể tích thuốc thử.
+Lấy 50 ml dung dịch Asen(III) 20g/l vào bình phản ứng hệ tạo Asin, thêm 1ml dung dịch KI 10%, 10ml dung dịch HCl 15% , và 4g Zn. Khuấy từ ở bình phản ứng trong thời gian 20 phút tạo ra hơi Asin, hơi Asin sẽ đƣợc dẫn vào bình hấp thụ của hệ tạo phức và phản ứng với dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat có thể tích thay đổi nhƣ trong bảng 3.3 tạo đƣợc hợp chất màu, sau đó, đo mật độ quang của hợp chất màu tại bƣớc sóng 520nm với dung dịch so sánh là clorofom , kết quả đƣợc chỉ ra trong bảng 3.3, và đƣợc biểu diễn trên hình 3.4.
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của thể tích thuốc thử tới độ hấp thụ quang (A) của hợp chất màu. STT Thể tích As(III) chuẩn (ml) Thể tích thuốc thử C5H10AgNS2(ml) CAsen(III) chuẩn (g/l) Mật độ quang (A) 1 50 2 20 0,195 2 50 4 20 0,180 3 50 6 20 0,178 4 50 8 20 0,170 5 50 10 20 0,150
Ảnh hưởng của thể tích thuốc thử tới độ hấp thụ quang (A) của hợp chất màu
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 2 4 6 8 10 Thể tích thuốc thử (ml) A b s Abs
Hình 3.4 Ảnh hưởng của thể tích thuốc thử tới độ hấp thụ quang (A) của hợp chất màu.
Dựa vào kết quả thu đƣợc trong bảng 3.3 và đồ thị hình 3.4 cho thấy, ở thể tích thuốc thử là 2ml hợp chất màu có độ hấp thụ quang là lớn nhất, và phép đo đạt độ nhạy cao nhất, sau đó mật độ quang giảm dần khi tăng thể tích thuốc thử. Tuy nhiên, khi sử dụng thể tích thuốc thử là 2ml, thì sau thời gian phản ứng 20 phút thì thể tích thể tích thuốc thử bị thay đổi nhiều do dung môi bay hơi, dẫn đến độ lặp lại của phép đo thấp, do vậy, vừa để đạt độ nhạy cao và độ lặp lại tốt chúng tôi sử dụng thể tích thuốc thử trong quá trình tạo hợp chất màu là 4ml .
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của thể tích mẫu.
Để xác định đƣợc thể tích mẫu thích hợp nhất cho quá trình phân tích,