Nguyín tắc
Cơ sở của việc định lượng protein theo phương phâp Lowry lă dựa văo phản ứng mău của protein với thuốc thử Folin tạo thănh phức chất có mău xanh hấp thu cực đại ở bước sóng 750nm. Cường độ mău của dung dịch tỉ lệ thuận với nồng độ protein. Phương phâp năy có độ nhạy cao, cho phĩp xâc định dung dịch mẫu chứa văi chục microgam protein.
Hoâ chất
- Dung dịch BSA chuẩn 200µg/mL pha trong dung dịch NaCl 0,9%. - Dung dịch A: Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N
- Dung dịch B: CuSO4 0,5% trong kali natri tartrat 1%
- Dung dịch C: Pha dung dịch A vă B theo tỉ lệ thể tích 49:1 trước khi dùng. - Thuốc thử Folin 1N:
+ Natri tungstate (Na2WO4.2H2O): 100g + Natri molypdate (Na2MoO4.2H2O): 25g
+ Nước cất: 700mL
Cho văo bình cầu đun cho tan rồi bổ sung thím:
+ Acid phosphoric 85%: 50mL
Đun sôi hổn hợp trong ống sinh hăn trong 10 giờ. Dung dịch trở thănh mău văng hay xanh lâ cđy thẫm. Tiếp tục cho thím:
+ Liti sulphate LiSO4: 150g
+ Brom: 5 giọt
+ Nước cất: 50mL
Đun sôi trong 15 phút. Dung dịch thu được có mău văng sâng. Nếu dung dịch có mău xanh thì phải xử lý với brom lần thứ hai. Sau khi lăm nguội thím nước cất đến 1 lít.
Xâc định lại nồng độ thuốc thử Folin bằng câch chuẩn độ với NaOH 1N với chỉ thị phenolphtalein. Chứa dung dịch trong chai nđu, bảo quản trong tủ lạnh.
Tiến hănh
a. Chuẩn bị dêy dung dịch protein chuẩn
Chuẩn bị dêy dung dịch protein chuẩn có nồng độ tăng dần từ 0 – 200 µg/mL từ dung dịch protein gốc (BSA 200 µg/mL), sau đó cho thím câc hoâ chất văo 6 ống nghiệm theo bảng sau:
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Nồng độ dung dịch (µg/mL) 0 40 80 120 160 200 Thể tích dd protein chuẩn (µL) 0 100 200 300 400 500 Thể tích dd NaCl 0,9% (µL) 500 400 300 200 100 0 Thể tích dung dịch C (mL) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 Thuốc thử Folin (µL) 250 250 250 250 250 250 b. Chuẩn bị dung dịch phđn tích:
Cho văo ống nghiệm:
- 1000 µL dd dung dịch phđn tích (Tính toân sao cho nồng độ protein trong dung dịch từ 20 –200 µg/mL)
- 4 mL dung dịch C - 0,5 mL thuốc thử Folin
Sau khi chuẩn bị câc dung dịch trín, lắc đều, để yín trong 30. Quan sât dêy dung dịch vă đo độ hấp thụ ở bước sóng 750 nm.
Vẽ đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ A văo nồng độ dung dịch protein chuẩn.
Từ giâ trị độ hấp thụ của dung dịch phđn tích, có thể suy ra nồng độ protein trong mẫu phđn tích dựa văo đường chuẩn.