Khi chiếu một chùm tia sâng đơn sắc có bước sóng λ, cường độ I0 qua một dung dịch có chiều dăy lớp dung dịch l, nồng độ C. Ta có:
Cường độ tia ânh sâng tới bằng tổng cường độ ânh sâng bị hấp thụ, ânh sâng bị phản xạ vă cường độ ânh sâng đi ra khỏi dung dịch (cường độ tia ló).
I0 = Ih + Ip + I Với:
- I0 : Cường độ tia ânh sâng tới - Ih: Cường độ ânh sâng bị hấp thụ
- Ip: Cường độ ânh sâng phản xạ - I: Cường độ tia ló
Vì lượng ânh sâng phản xạ rất nhỏ, có thể bỏ qua, nín ta có: I0 = Ih + I
Định luật Lambert- Beer mô tả mối liín hệ giữa câc yếu tố trín như sau:
“Khi ânh sâng đơn sắc đi qua dung dịch chứa chất hấp thụ, cường độ ânh sâng bị hấp thụ sẽ phụ thuộc văo nồng độ dung dịch vă chiều dăi của đường truyền ânh sâng qua dung dịch”.
log (I0/I) = εx C x l
Trong đó:
- I0 : Cường độ tia ânh sâng tới - I: Cường độ tia ló
- ε: hệ số hấp thụ phđn tử - C: Nồng độ dung dịch
- l: chiều dăi của đường truyền ânh sâng qua dung dịch (cm)
Giâ trị log(I0/I) được gọi lă độ hấp thụ (A - absorbance) hay mật độ quang (OD - optical density).
A
Ax
Trong cùng một điều kiện, khi ε vă l không đổi, thì độ hấp thụ sẽ tỉ lệ thuận với nồng độ chất mău. Vì vậy ta có thể xđy dựng đường chuẩn sự phụ thuộc của độ hấp thụ văo nồng độ dung dịch chuẩn. Từ đó ta có thể xâc định được nồng độ của dung dịch protein cần phđn tích khi biết được độ hấp thụ của dung dịch năy. Đường chuẩn được xđy dựng bằng sự phụ thuộc của giâ trị độ hấp thụ theo nồng độ dung dịch.
Thông thường, để có kết quả phđn tích với độ chính xâc cao, người ta chọn điều kiện sao cho độ hấp thụ nằm trong khoảng 0,1 – 1, tốt nhất lă từ 0,2 – 0,5.