Nguyín tắc
Trong môi trường kiềm, câc hợp chất có chứa nhóm –CO-NH-, -CS-NH-, - C(NH)NH2 sẽ có phản ứng với Cu2+ tạo hợp chất phức mău tím.
Trong thí nghiệm năy, protein được cho phản ứng với Cu2+ trong môi trường kiềm để tạo phức mău tím; cường độ mău tỉ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Do đó ta có thể định lượng protein theo phương phâp so mău ở bước sóng 550 nm.
Vật liệu-Thuốc thử
a. Dung dịch protein chuẩn:
Dung dịch albumin huyết thanh bò (BSA – bovine serum albumin) 20 mg/mL pha trong dung dịch NaCl 0,9 %.
b. Dung dịch lòng trắng trứng (dung dịch phđn tích)
Cđn chính xâc khoảng 4g lòng trắng trứng, cho văo bình định mức 50 mL. Dùng dd NaCl 0,9% đưa lín đến vạch.
c. Thuốc thử Biuret
- CuSO4.5H2O 1,5g - K, Na tartrat 6g
- NaOH 30g (Pha trong 1lít dung dịch)
Tiến hănh
a. Chuẩn bị dêy dung dịch protein chuẩn
Chuẩn bị dêy dung dịch protein chuẩn có nồng độ tăng dần từ 0 – 20 mg/mL từ dung dịch protein gốc (BSA 20 mg/mL)
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Nồng độ dung dịch (mg/mL) 0 4 8 12 16 20 Thể tích dd protein chuẩn (µL) 0 100 200 300 400 500 Thể tích dd NaCl 0,9% (µL) 500 400 300 200 100 0 Thể tích nước cất (mL) 1 1 1 1 1 1 Thuốc thử Biuret (mL) 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5
b. Chuẩn bị dung dịch phđn tích:
Cho văo ống nghiệm:
- 500 µL dung dịch protein trứng (dung dịch phđn tích) - 1 mL nước cất
- 3,5 mL thuốc thử biuret
Sau khi chuẩn bị câc dung dịch trín, lắc đều, để yín 20 phút. Quan sât dêy dung dịch vă đo độ hấp thụ ở bước sóng 550 nm.
Vẽ đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ A văo nồng độ dung dịch protein chuẩn.
Từ giâ trị độ hấp thụ của dung dịch phđn tích, có thể suy ra nồng độ protein trong mẫu dựa văo đường chuẩn.
Tính kết quả:
Từ kết quả đọc được trín mây, ta xâc định được nồng độ protein trứng trong dung dịch phđn tích: x mg/mL.
Hăm lượng protein trong lòng trắng trứng được tính theo công thức sau:
C (mg/100g) = (50 x x x 100)/a
Trong đó:
x: nồng độ protein trứng trong dung dịch phđn tích đọc được trín mây (mg/mL).
a: số gam lòng trắng trứng đem phđn tích.