C chuẩn thêm vào
3.2.3. Các kỹ thuật HPLC.
Có 4 kỹ thuật HPLC cơ bản: Sắc ký phân bố, hấp phụ, trao đổi ion và sắc ký loại cỡ (rây phân tử). Trong phạm vi cuốn sách, chủ yếu chúng tôi giới thiệu về sắc ký phân bố, vì đây là kỹ thuật HPLC đ−ợc sử dụng nhiều nhất trong kiểm nghiệm thuốc. Còn các kỹ thuật khác, chỉ có tính chất giới thiệu tóm tắt.
Sắc ký phân bố hiệu năng cao (Partition Chromatography)
Pha tĩnh
Pha tĩnh trong sắc ký phân bố bao gồm một lớp mỏng pha lỏng hữu cơ bao trên bề mặt của các tiểu phân chất mang silica hoặc các chất liệu khác. Các tiểu phân này th−ờng có đ−ờng kính từ 3 đến 10 àm, cỡ hạt có thể tăng đến 50 àm hoặc lớn hơn cho sắc ký điều chế. Sắc ký dùng loại pha tĩnh này đ−ợc gọi là sắc ký lỏng- lỏng (Liquid - liquid Chromatography - LLC). Nh−ng kiểu pha tĩnh này có nh−ợc điểm là bị rửa trôi dần theo dòng pha động. Kết quả, hiệu lực cột bị giảm dần trong quá trình sử dụng.
Để khắc phục nh−ợc điểm trên, ng−ời ta đã sử dụng kỹ thuật sắc ký pha liên kết (Bonded- Phase Chromatography - BPC). Trong kỹ thuật này, pha tĩnh đ−ợc liên kết hóa học với chất mang. Kỹ thuật này đã nhanh chóng trở thành kỹ thuật phổ biến nhất trong HPLC. Trong loại pha tĩnh này, các nhóm chức hữu cơ liên kết với bề mặt của các tiểu phân silica qua các nhóm silanol. Tính phân cực của loại pha tĩnh này phụ thuộc vào tính phân cực của các nhóm chức liên kết, chúng ở trong vùng từ nhóm không phân cực octadecyl silan đến nhóm rất phân cực nitril.
D−ới đây là một số pha liên kết th−ờng dùng: Octyl = Si- (CH2))7- CH3 C8 Octadecyl = Si- (CH2))17- CH3 C18 Phenyl = Si- (CH2)n- C6H5 C6H5 Cyanopropyl = Si- (CH2)3- CN CN Aminopropyl = Si- (CH2)3- NH2 NH2 Diol = Si- (CH2)3- OCH (OH) - CH2- OH
Hệ bao gồm pha tĩnh phân cực và pha động không phân cực đ−ợc gọi là sắc ký pha thuận. Ng−ợc lại, pha động phân cực còn pha tĩnh không phân cực, đ−ợc gọi là sắc ký pha đảo.
− Khi sử dụng silica, nhôm oxyd hoặc polyme xốp thì các chất đ−ợc phân tách theo cơ chế hấp phụ nên đ−ợc gọi là sắc ký hấp phụ.
− Nếu pha tĩnh là nhựa trao đổi ion thì gọi là sắc ký trao đổi ion .
− Nếu pha tĩnh là polyme xốp nh− dextran..., ta có sắc ký loại cỡ (sắc ký rây phân tử Size Exclution Chromatography).
Pha động
ái lực của một thành phần đối với pha tĩnh hay nói một cách khác, thời gian l−u giữ của nó ở trên cột đ−ợc điều khiển bằng cách thay đổi độ phân cực của pha động. Pha động có thể là dung môi đơn hay hỗn hợp của 2, 3 hay 4 thành phần. Ng−ời ta có thể thay đổi độ phân cực của pha động bằng cách thay đổi tỷ lệ của các thành phần dung môi trong hỗn hợp. Kỹ thuật thay đổi liên tục thành phần dung môi trong thời gian chạy sắc ký đ−ợc gọi là rửa giải gradient hoặc ch−ơng trình hóa dung môi.
Tuỳ thuộc vào việc sử dụng pha động và pha tĩnh ng−ời ta chia sắc ký phân bố thành 2 loại (sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo):
* Sắc ký pha thuận (normal phase):
Trong kỹ thuật này ng−ời ta sử dụng chất nạp cột (packings) gồm các nhóm phân cực liên kết với chất mang nh− nhóm alkylnitril [-(CH2)nCN ] và alkylamin [-(CH2)nNH2]. Dung môi sử dụng là dung môi của sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn - LSC). Kỹ thuật này, sử dụng pha tĩnh phân cực hơn pha động, đ−ợc gọi là sắc ký phân bố pha thuận. Sự phân tách đạt đ−ợc bằng sắc ký pha thuận cũng t−ơng tự nh− ở LSC. Song pha tĩnh trong sắc ký pha liên kết có −u điểm hơn pha tĩnh trong LSC:
. Cột nhanh đạt cân bằng nên rất thuận lợi cho phân tách gradient. . Cột thích hợp với nhiều dung môi và dễ tái sinh.
. Cột rất bền.
. Cột alkylamin có thể có chức năng nh− một cột trao đổi anion yếu. Pha động trong sắc ký pha thuận nói chung không phân cực, th−ờng dùng hỗn hợp của các hydrocarbon mạch thẳng nh− pentan, hexan, heptan, isootan. Các dẫn chất halogen dãy béo cũng đ−ợc sử dụng nh−: diclorometan, dicloroetan, butyl clorid và cloroform. Có thể thêm vào các pha khan n−ớc này 1- 2% acid acetic hoặc phosphoric để ngăn cản sự ion hóa của các chất nh−: các phenol, acid carboxylic. Ng−ợc lại, sự ion hóa của các base yếu có thể đ−ợc kìm lại bằng cách thêm một l−ợng nhỏ amoniac hoặc một amin khác (0,1- 1%). Ngoài ra cũng có thể thêm vào pha động những chất cải biến hữu cơ (organic modifier) khác nh− các alcohol, tetrahydrofuran.
Nói chung, việc đuổi khí hòa tan không thành vấn đề với dung môi pha thuận.
Trong kỹ thuật sắc ký pha thuận các chất không phân cực sẽ đ−ợc rửa giải sớm. Thứ tự rửa giải sẽ chậm dần theo chiều tăng của độ phân cực của các thành phần trong mẫu thử.
Ví dụ: Tách hỗn hợp steorid bằng sắc ký pha thuận. Điều kiện sắc ký:
- Cột: MicroPak – NH2 2,2 x 150 mm, 5 àm. - Pha động: hexan chứa 0,2% isopropanol. - Tốc độ dòng: 1 ml/ phút.
- Detector: UV 254 nm
phút
Hình 3.6: Sắc đồ tách các steroid
1- Progesterone 5- Andrenosterone
2- Androstendione 6- Cortisone acetat
3- ∆4- pregnon-20-β-ol-one 7- Cortisone
4- 17-α-hydroxyprogesterone 8- Hydrocortisone
* Sắc ký pha đảo (reversed phase) :
Trong kiểm nghiệm thuốc bằng ph−ơng pháp HPLC, sắc ký phân bố pha đảo đ−ợc sử dụng nhiều nhất.
Trong kỹ thuật này pha tĩnh bao gồm các nhóm không phân cực nh−
octadecyl (C18), octyl (C8) hay phenyl (C6H5). Pha động là những dung môi phân cực nh−: n−ớc, methanol (MeOH), acetonitril (ACN). Tóm lại, pha động phân cực hơn pha tĩnh.
Độ chọn lọc của kỹ thuật này khác biệt đáng kể với quá trình tách trên pha thuận. Ng−ời ta thấy rằng, một chất càng tan tốt trong n−ớc thì nó đ−ợc rửa giải khỏi cột càng nhanh. Quy tắc rửa giải này ng−ợc với pha thuận.
Với các chất đ−ợc rửa giải quá sớm trong sắc ký pha thuận, chúng sẽ rất khó tách rời khỏi nhau. Trong khi đó, ở pha đảo các thành phần này sẽ đ−ợc rửa giải vào gần cuối của quá trình sắc ký làm cho việc tách dễ dàng hơn (có nghĩa là k’ lớn hơn).
Khi một pic nhỏ đ−ợc rửa giải sau một pic lớn thì th−ờng rất khó định l−ợng bằng sắc ký pha thuận. Tuy nhiên dãy rửa giải có thể đảo ng−ợc lại bằng cách dùng sắc ký pha đảo. Khi đó pic nhỏ có thể đ−ợc xác định chính xác hơn.
Thành phần đầu tiên của pha động trong sắc ký pha đảo là n−ớc. Những dung môi hòa lẫn đ−ợc với n−ớc nh− methanol, ethanol (EtOH), acetonitril, dioxan, tetrahydrofuran (THF) và dimethylformamid đ−ợc thêm vào để điều chỉnh độ phân cực của pha động. Một số thành phần khác cũng có thể đ−ợc thêm vào pha động nh−: các acid, base, đệm , chất diện hoạt.
Cặp dung môi đ−ợc sử dụng phổ biến nhất trong sắc ký pha đảo là:
H2O - MeOH và H2O – ACN. Điều dễ nhận thấy, MeOH có nh−ợc điểm là độ nhớt cao của nó có thể làm giảm hiệu lực cột. Trong khi ACN có độ nhớt thấp hơn, thích hợp hơn với các chất không phân cực vì thế nó th−ờng đ−ợc dùng nhiều hơn MeOH. Thời gian l−u sẽ ngắn hơn nếu nồng độ ACN bằng nồng độ MeOH.
Chú ý: Khi pha động có thêm các muối vô cơ hoặc các chất hoạt động bề mặt, nên lọc nó tr−ớc khi dùng vì có thể có cặn không tan trong n−ớc gây bẩn cột.
Việc đuổi khí rất quan trọng với pha động pha đảo.
Về thứ tự rửa giải: Trong sắc ký pha đảo các chất phân cực ra tr−ớc, các chất ít và không phân cực ra sau.
Ví dụ: Tách hỗn hợp morphin, codein và heroin bằng HPLC pha đảo (hình 3.7). Điều kiện sắc ký: - Cột: Zorbax Rx, Sb- C 8, 4,6 x 150 mm, 5àm. - Pha động: ACN/KH2PO4 25 mM, pH 3,5 7/ 93. - Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút - Detector: UV 254 nm
Hình 3.7: Sắc đồ tách morphin, codein, heroin.
Phút