Hình thái tế bào
Môi trường chuẩn BG 11các tế bào vi tảo có sắc tố đẹp cho đến ngày 4, sang ngày thứ 5, thứ 6 một số tế bào có hiện tượng thoát sắc tố ra môi trường nuôi và nhạt màu dần, kích thước trung bình của tế bào trong môi trường này là 6,5 µm (ảnh 3.41).
BG 11 BA 10-16 BA 10-18 BA 10-20 Cư ờn g đ ộ h ô h ấp (x 10.000 μ m ol O2 .h -1 .10 -6 tế bào )
Thời gian (ngày)
6,5 µm
6,5 µm N4
Ảnh 3.41. Hình thái tế bào N.palea trong môi trường chuẩn từ ngày 4 đến ngày 7 (x40). Trong môi trường bổ sung AIA ở nồng độ 10-18
g/ml kết hợp BA ở nồng độ 10-18 g/ml tế bào vi tảo có sắc tố đậm và đẹp cho tới ngày thứ 6, sang ngày 8 có hiện tượng dồn và thoát sắc tố ra môi trường nuôi. Kích thước trung bình của tế bào trong môi trường này đạt 8,1 µm (hình 3.42).
Ảnh 3.42. Hình thái tế bào N.palea trong môi trường bổ sung AIA 10-18
g/ml kết hợp với BA 10-18 g/ml từ ngày 4 đến ngày 7 (x40).
Trong môi trường bổ sung AIA ở nồng độ 10-20
g/ml kết hợp với BA ở nồng độ 10-18 g/ml tế bào vi tảo có sắc tố đậm và đẹp cho tới ngày thứ 6, ở ngày thứ 7 bắt đầu có hiện tượng dồn sắc tố trong tế bào, sang ngày 8 các thể sắc tố thoát ra môi trường nuôi. Kích thước trung bình của tế bào trong môi trường này đạt 7,9 µm (ảnh 3.43).
6,5 µm 6,5 µm 6,5 µm 6,5 µm N6 N4 N5 N7 6,5 µm N7 6,5 µm 6,5 µm 6,5 µm N6 N4 N5
Ảnh 3.43. Hình thái tế bào N.palea trong môi trường bổ sung AIA 10-20 g/ml kết hợp với BA 10-18 g/ml từ ngày 4 đến ngày 7 (x40).
Mật độ tế bào - Đường cong tăng trưởng - Tốc độ tăng trưởng
Từ ngày 1 đến ngày 4 quần thể vi tảo trong cả 3 môi trường sinh trưởng với tốc độ gần như nhau (bảng 3.20). Trong khi môi trường chuẩn đạt mật độ tế bào cao nhất vào ngày 4 thì hai môi trường bổ sung AIA và BA kết hợp có mật độ tế bào cao nhất vào ngày 6, nhìn chung cả hai môi trường này đều có tốc độ tăng trưởng và mật độ tế bào cao hơn hẳn so với môi trường chuẩn. Môi trường bổ sung AIA ở nồng độ 10-18
g/ml kết hợp với BA ở nồng độ 10-18 g/ml quần thể vi tảo tăng trưởng mạnh nhất và đạt mật độ tế bào cao nhất (bảng 3.19).
Trong khi đường cong tăng trưởng của môi trường chuẩn bắt đầu giảm xuống từ ngày 5 thì các môi trường bổ sung AIA và BA kết hợp tốc độ tăng trưởng và đường cong tăng trưởng vẫn duy trì tốt hơn (hình 3.22).
Bảng 3.19. Mật độ tế bào N.palea trong các môi trường bổ sung AIA 10-18 g/ml kết hợp BA 10-18 g/ml và môi trường bổ sung AIA 10-20
g/ml kết hợp BA 10-18 g/ml.
Thời gian tăng trưởng
(ngày)
Mật độ tế bào ở các môi trường (đơn vị tính x 104
tb/ml) BG 11 AIA 10-18 , BA 10-18 AIA 10-20 , BA 10-18 1 1,67 ± 0,251a 1,31 ± 0,291a 1,42 ± 0,0281a 2 19,4 ± 0,0752a 26,1 ± 0,0652b 22,5 ± 0,072ab 3 53,6 ± 0,0453a 57,5 ± 0,0443a 54,5 ± 0,0453a 4 71,7 ± 0,0394a 75,8 ± 0,0384a 70,8 ± 0,0394a 5 65,7 ± 0,0414a 82,9 ± 0,0365c 73,5 ± 0,0384b 6 66,9 ± 0,0394a 98,9 ± 0,0335c 81,8 ± 0,0365b 7 66,9 ± 0,0394a 91,9 ± 0,0345c 77,2 ± 0,03745b 6,5 µm 6,5 µm N6 N7
8 62,1 ± 0,0424a 89,4 ± 0,0355c 75,7 ± 0,0384b
9 55,2 ± 0,04434a 77,5 ± 0,03745c 66,4 ± 0,044b
10 43,4 ± 0,053a 73,8 ± 0,0384c 60,00 ± 0,04334b
Các số trung bình trong hàng với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05. Các số trung bình trong cột với các chữ số khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.22: Đường cong tăng trưởng của N.palea trong các môi trường bổ sung AIA 10-18 g/ml kết hợp BA 10-18 g/ml và môi trường bổ sung AIA 10-20 g/ml kết hợp BA 10-18 g/ml.
Bảng 3.20. Tốc độ tăng trưởng của vi tảo N.palea trong các môi trường bổ sung AIA 10-18 g/ml kết hợp BA 10-18 g/ml và môi trường bổ sung AIA 10-20 g/ml kết hợp BA 10-18 g/ml.
Ngày
Tốc độ tăng trưởng/ngày ở các môi trường
BG 11 AIA 10-18 , BA 10-18 AIA 10-20 , BA 10-18 1-2 2,45 ± 0,016a 3,01 ± 0,245a 2,83 ± 0,155a 2-3 1,02 ± 0,025a 0,79 ± 0,094a 0,87 ± 0,044a 3-4 0,29 ± 0,024a 0,29 ± 0,063a 0,30 ± 0,073a 4-5 -0,09 ± 0,012a 0,09 ± 0,012b 0,01 ± 0,022b 5-6 0,06 ± 0,013a 0,18 ± 0,013b 0,11 ± 0,001ab 6-7 0,001± 0,0012b -0,07 ± 0,011a -0,05 ± 0,011a 7-8 -0,12 ± 0,0312a -0,03 ± 0,011b -0,02 ± 0,0011b 8-9 -0,15 ± 0,13512a -0,15 ± 0,0241a -0,13 ± 0,021a 9-10 -0,26 ± 0,531a -0,05 ± 0,021b -0,10 ± 0,0091ab M ật độ tế b à o ( x 10. 0 00 tb /m l)
Thời gian tăng trưởng/ngày
AIA 10-18 & BA 10-18
AIA 10-20 & BA 10-18
Các số trung bình trong hàng với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05. Các số trung bình trong cột với các chữ số khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05.
Cường độ quang hợp và cường độ hô hấp
Trong môi trường bổ sung AIA 10-18 g/ml kết hợp BA 10-18 g/ml CĐQH cao nhất và giá trị cao nhất đạt được vào ngày 6. Tiếp đến là môi trường bổ sung AIA 10-20
g/ml kết hợp BA 10-18 g/ml. Môi trường chuẩn có CĐQH thấp hơn hẳn so với hai môi trường bổ sung AIA và BA kết hợp (hình 3.23).
Hình 3.23: Cường độ quang hợp của N. palea trong các môi trường bổ sung AIA 10-18
g/ml kết hợp BA 10-18 g/ml, môi trường bổ sung AIA 10-20
g/ml kết hợp BA 10-18 g/ml.
Môi trường bổ sung AIA 10-18 g/ml kết hợp BA 10-18 g/ml CĐHH là cao nhất và giá trị cao nhất đạt được vào ngày 6. Tiếp đến là môi trường bổ sung AIA 10-20
g/ml kết hợp BA 10-18 g/ml. Môi trường chuẩn BG 11 có CĐHH thấp nhất và thấp hơn hẳn so với hai môi trường bổ sung AIA và BA kết hợp (hình 3.24).
BG 11 AIA 10-18 & BA 10-18 AIA 10-20 & BA 10-18 Cư ờn g đ ộ q u an g h ợp (x 10.000 μ m ol O2 .h -1 .10 -6 tế bào)
Hình 3.24: Cường độ quang hợp của vi tảo N. palea trong các môi trường bổ sung AIA 10-18 g/ml kết hợp BA 10-18
g/ml, môi trường bổ sung AIA 10-20
g/ml kết hợp BA 10-18 g/ml.
Kết hợp các yếu tố về hình thái tế bào, đường cong tăng trưởng, tốc độ tăng trưởng và CĐQH, CĐHH thì môi trường bổ sung AIA 10-18
g/ml kết hợp với BA 10-18
g/ml và môi trường bổ sung AIA 10-20
g/ml kết hợp với BA 10-18
g/ml quần thể vi tảo tăng trưởng mạnh và tốt hơn so với chuẩn, trong đó môi trường bổ sung AIA 10-18 g/ml kết hợp BA 10-18 g/ml là tốt nhất.
B. Thảo luận
3.2.1 Sự sinh trưởng của vi tảo Nitzschia palea khi nuôi cấy trong điều kiện phòng thí
nghiệm
Môi trường nước ngọt hiển thị một sự giàu có của hệ thực vật và tảo. Sự phân bố của tảo các loài nước ngọt không chỉ phụ thuộc vào việc lựa chọn môi trường hóa học mà còn dựa trên khả năng thích nghi ở một môi trường cụ thể của sinh vật. Do đó, các môi trường nuôi khác nhau đã được phát triển và được sử dụng để phân lập và nuôi dưỡng tảo nước ngọt. Vài môi trường đã được thay đổi công thức để đáp ứng các đối tượng cụ thể, một số môi trường được xây dựng từ phân tích nước trong môi trường sống tự nhiên, một số được xây dựng sau khi nghiên cứu chi tiết về yêu cầu dinh dưỡng của cơ thể, và một số được thành lập sau khi xem xét các thông số sinh thái (Andersen, 2005). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
BG 11 AIA 10-18 & BA 10-18 AIA 10-20 & BA 10-18 Cư ờn g đ ộ h ô h ấp (x 10.000 μ m ol O2 .h -1 .10 -6 tế b ào)
N. palea là tảo silic nước ngọt, có nhiều môi trường nước ngọt nhân tạo nhưng ưu tiên lựa chọn môi trường chứa silic và 3 môi trường được chọn là môi trường Half Strength Chu #10 (Nalewajko và O’Mahony, 1989), môi trường BG - 11sửa đổi (Allen 1968, Allen and Stanier 1968, Rippka et. al., 1979) và môi trường Combo (Guillard và Lorenzents, 1972). Môi trường Half Strength Chu #10 được sử dụng để phát triển Chlamydomonas vernalis Skuja, Nitzschia sp, và Oscillatoria utermoehlii (Andersen, 2005). Môi trường Combo bắt nguồn từ môi trường Guillard và Lorenzen của WC (1972) (ví dụ, loại bỏ các glycylglycine hoặc Tris đệm, sửa đổi các nguyên tố vi lượng) và thêm 1 ml của vi lượng kim loại. Môi trường này được sử dụng hỗ trợ tăng trưởng mạnh mẽ đối với vi khuẩn, cryptophytes, tảo xanh, và tảo silic (Andersen, 2005). Môi trường BG - 11sửa đổi bắt nguồn từ môi trường BG - 11 (Hughes et al., 1958.) dùng nuôi cấy tảo nước ngọt, trong đó có tảo silic và vi khuẩn lam (Andersen, 2005).
Ở môi trường Half Strength Chu #10 mật độ tế bào thấp nhất, tốc độ tăng trưởng chậm, có lẽ do tỉ lệ các chất dinh dưỡng có trong môi trường không thích hợp cho sự tăng trưởng của loài vi tảo này. Ở môi trường Combo mật độ tế bào cao, tuy nhiên đường cong tăng trưởng và tốc độ tăng trưởng không ổn định. Trong 3 môi trường trên thì trong môi trường BG 11 tế bào có hình thái đẹp, đường cong tăng trưởng dạng chữ S điển hình và tốc độ tăng trưởng của quần thể vi tảo cao. Điều này chứng tỏ môi trường BG 11 là thích hợp hơn cả cho sự sinh trưởng của vi tảo N. paleatrong điều kiện phòng thí nghiệm.
Có thể nói các môi trường nước ngọt nhân tạo được sử dụng rất phổ biến trên thế giới nhưng ở Việt Nam hầu như chưa được áp dụng rộng rãi. Tùy từng đối tượng vi tảo mà môi trường nước ngọt nhân tạo nào sẽ thích hợp cho sự sinh trưởng của tảo và mỗi loài thích hợp với điều kiện pH khác nhau của từng môi trường. Vì thế cùng là nước ngọt nhân tạo nhưng sự tăng trưởng của N. paleatrong môi trường BG - 11 phát triển mạnh hơn các môi trường Combo và Half Strength Chu #10 thông qua hình thái tế bào, mật độ tế bào và đường cong tăng trưởng.
Mật độ ban đầu là một trong những yếu tố có liên quan mật thiết đến sinh khối và thời gian tảo đạt cực đại. Tùy loài tảo khác nhau mà mật độ nuôi cấy ban đầu cũng khác nhau (Nguyễn Thanh Mai và cộng sự, 2009).
Mật độ cấy chuyền thích hợp là một yếu tố quan trọng trong quá trình khảo sát vi tảo. Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về mật độ cấy chuyền của vi tảo như loài Nitzschia sp.
được nuôi cấy ở mật độ 2.103 tế bào/ml (Nguyễn Thị Lĩnh và cộng sự, 1999); loài
Chaetoceros lauderi và Chaetoceros subtilis nuôi ở mật độ 5.103
tế bào/ml (Nguyễn Thị Kim Ánh, 2009); loài Thalassiosira sp. nuôi ở mật độ 5.103 tế bào/ml (Nguyễn Tấn Đại, 2007). Nếu cấy chuyền ở mật độ xuất phát quá thấp sẽ không kích thích được sự tăng trưởng của vi tảo, dẫn đến tốc độ tăng trưởng chậm và không ổn định, ngược lại nếu cấy chuyền ở mật độ ban đầu quá cao, vi tảo sẽ cạnh tranh nhau về ánh sáng và nguồn dinh dưỡng gây ức chế quá trình tăng trưởng. Như vậy việc xác định mật độ là rất cần thiết cho mỗi loài cụ thể, 4 mật độ được lựa chọn để khảo sát đối với N.palea là 2,5.103 tế bào/ml; 5.103
tế bào/ml; 7,5.103 tế bào/ml; 10.103 tế bào/ml. Ở hai mật độ thấp là 2,5.103 tế bào/ml và 5.103 tế bào/ml thời gian để thích nghi của tế bào kéo dài do ban đầu mật độ thấp nên tốc độ phân chia tế bào thấp, kết quả là mật độ tế bào và tốc độ tăng trưởng của quẩn thể vi tảo trong môi trường nuôi thấp hơn nhiều so với hai mật độ còn lại. Ở mật độ 7,5.103 tế bào/ml tuy mật độ tế bào cao nhưng đường cong tăng trưởng và tốc độ tăng trưởng không ổn định. Trong 4 mật độ trên thì mật độ thích hợp nhất là 10.103
tế bào/ml. Ở mật độ này đường cong tăng trưởng ổn định, điển hình, tốc độ tăng trưởng tốt, thời gian tăng trưởng không quá dài, phù hợp để khảo sát trong điều kiện phòng thí nghiệm nên được lựa chọn cho các nghiệm thức tiếp theo.
Thời điểm lấy mẫu để bố trí thí nghiệm cũng là một trong những yếu tố quan trọng khi nghiên cứu sinh lí của vi tảo, ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng của quần thể, đến chất lượng tế bào cũng như khả năng tăng sinh khối. Nếu lấy mẫu cấy chuyền sớm vào những ngày đầu tiên thì vi tảo còn trong pha thích nghi, đường cong tăng trưởng và tốc độ tăng trưởng không ổn định. Nếu lấy mẫu cấy chuyền khi quần thể đã bước vào pha cân bằng, lúc này trong môi trường nuôi lượng sản phẩm thải nhiều, tốc độ tăng trưởng của các tế bào chậm, chất lượng tế bào suy giảm. Vì vậy, thời điểm cấy chuyền thích hợp nhất là vào pha lũy thừa. Các thời điểm được lựa chọn để khảo sát là ngày 3, 4 và 5. Trong đó, cấy chuyền vào ngày thứ 4 có đường cong tăng trưởng ổn định, tốc độ tăng trưởng tốt và được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.3 Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
3.2.3.1 Ảnh hưởng của AIA
Trên thế giới đã có những nghiên cứu về các chất điều hòa tăng trưởng ở thực vật đối với vi tảo. Theo TD Li, Doronina, Ivanova, & Trotsenko, 2007 Auxin là phytohormone phổ
biến ở thực vật, có tác dụng chủ yếu là kéo dài tế bào thực vật và cũng được tìm thấy trong tảo. Sự hiện diện này cho biết rằng đã có auxin ảnh hưởng đến sự phát triển tảo. Những nghiên cứu về phytohormone chỉ ra rằng chúng thể có tiềm năng để tăng tốc độ tăng trưởng của C.reinhardtii bởi vì chúng được sử dụng để tăng tốc độ tăng trưởng trong các thực vật. Auxin có tác dụng giống nhau giữa tảo và thực vật bậc cao (Conrad H., et.al., 1959). Có nhiều báo cáo về sự ảnh hưởng của AIA lên sự tăng trưởng của tảo và nồng độ AIA rất quan trọng để xác định xem chúng có tác dụng thúc đẩy, ức chế hoặc không có ảnh hưởng lên sự tăng trưởng ở những loài cụ thể (Yau P. C., et. al., 1971).
Trái với nhiều thông tin về trao đổi chất và vận chuyển của IAA trong thực vật cao, sự trao đổi chất của AIA trong tảo còn ít được biết đến (Sandberg et al., 1990, Ljung et al., 2005).
Ở loài Coelastrum microporum Naeg., AIA nồng độ 30 ppm không có tác dụng đến sự sinh trưởng, nồng độ 100 ppm có tác dụng ức chế (Yau P. C., et. al., 1971). Đối với loài
Chlorella pyrenoidosa, Scenedesmus obliquus, xử lý AIA 10-3 M lại không xảy ra tác dụng ức chế (Ahmad M. R., et. al., 1968). Ở loài Skeletonema costatum, xử lý AIA nồng độ 10- 10 g/ml và 10-11 g/ml cải thiện sự tăng trưởng (Bentley J. A., 1958). AIA các nồng độ 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 g/ml làm giảm sự tăng trưởng ở loài Chaetoceros lauderi và Chaetoceros subtilis (Nguyễn Thị Kim Ánh, 2008). Pratt R. (1937), Brannon M. A. và cộng sự (1945) cho rằng AIA chỉ có tác dụng kích thích ở nồng độ cao, còn Conrad H. (1959) lại cho rằng AIA ở nồng độ cao gây ức chế ở tảo lục Ulothrix. Leonian và cộng sự (1973) đã chứng