1.9.1. Đảo trộn
Đảo trộn là cần thiết để ngăn chặn sự lắng của tảo, để đảm bảo rằng tất cả các tế bào tảo đều tiếp xúc với ánh sáng và chất dinh dưỡng, và để cải thiện sự trao đổi khí giữa môi trường nuôi cấy và không khí. Và quan trọng chính là cung cấp nguồn carbon cho quang hợp của vi tảo. Đối với môi trường nuôi cấy dày đặc, hàm lượng CO2 có nguồn gốc từ không khí (có chứa 0,03% CO2) là hạn chế sự phát triển của vi tảo và khí carbon tinh khiết có thể được bổ sung với việc cung cấp không khí (ví dụ, ở một tỷ lệ là 1% khối lượng của không khí). Ngoài CO2 hệ đệm có thể chống lại sự thay đổi pH như là hệ đệm cân bằng CO2/H2CO3 (Anderson, 2005).
Việc đảo trộn của nuôi cấy vi tảo có thể cần thiết trong những điều kiện nhất định (trong nuôi cấy tập trung để ngăn chặn tác dụng hạn chế chất dinh dưỡng do sự sắp xếp của các tế bào và làm tăng khuếch tán khí). Cần lưu ý rằng đối với tảo biển ít khi gặp bất ổn, và do đó trộn nên nhẹ nhàng. Tùy thuộc vào quy mô của hệ thống nuôi cấy, sự đảo trộn có thể được thực hiện bằng tay (lắc ống nghiệm, bình tam giác), làm thoáng khí, hoặc bằng cách sục khí. Không phải tất cả các loài tảo có thể chịu đựng sự khuấy trộn mạnh mẽ, sinh vật phù du quay khoảng 1 vòng/phút. Hầu hết tảo nuôi cấy tốt mà không cần đảo trộn, đặc biệt khi không quá tập trung, nhưng khi có thể thì nên lắc nhẹ nhàng mỗi ngày một lần (Taylor & Francis Group, 2006). Tần số lắc có thể từ 6-80 vòng/phút và tần số tối ưu là 60 vòng/phút (Anderson, 2005).
1.9.2. Bình nuôi cấy
Bình nuôi cấy cần phải có các thuộc tính sau: không độc (trơ hóa học); trong suốt với ánh sáng, dễ dàng lau chùi và khử trùng; và cung cấp một bề mặt lớn đến tỷ lệ khối lượng (tùy thuộc vào đối tượng nuôi). Thường sử dụng bình thủy tinh hình nón có kích thước khác nhau (vài chục ml đến vài lít) hoặc các ống nghiệm đối với nuôi cấy lỏng và các đĩa petri đối với nuôi cấy trên thạch. Vật liệu nói chung nên tránh trong quá trình nuôi vi tảo bao gồm tất cả các loại cao su và nhựa PVC (Taylor & Francis Group, 2006).
1.9.3. Lựa chọn và chuẩn bị môi trường
Khi chọn một môi trường nuôi cấy, cần xem xét môi trường sống tự nhiên của các loài để xác định các yêu cầu môi trường của nó. Việc lựa chọn sao cho đảm bảo tốc độ tăng trưởng nhanh chóng của vi tảo. Cần sàng lọc các thành phần môi trường đã được nghiên cứu đối với phòng thí nghiệm trong nhiều thập kỉ qua. Các môi trường hiện đang có sẵn công thức không phải luôn luôn thích hợp đối với nhiều loài, và sự lựa chọn chính xác đối với một loài đặc biệt phụ thuộc vào thử và sai. Một cách khác để chuẩn bị môi trường nhân tạo được thực hiện là kết hợp các thành phần với nhau. Hỗn hợp sau đó được chuyển vào một bình sạch có kích thước phù hợp. Môi trường được khử trùng bằng cách hấp ở 1210C (20 phút, 1 atm) hoặc bằng cách lọc, sử dụng lỗ lọc cellulose nitrat 0,2 mm để vô trùng. Việc cấy truyền được thực hiện bằng cách sử dụng kỹ thuật vi sinh vô trùng. Môi trường thường được chế biến từ dung dịch stock, các stock được cân đo và bổ sung vào một thể tích nước. Một số thành phần có thể thêm trực tiếp vào một lượng chất lỏng nhất định.Việc cân đo dung dịch stock hoặc nước, và trọng lượng của hóa chất cần chính xác. Không đúng quy trình có thể dẫn đến kết tủa của một hoặc nhiều thành phần của môi trường, chẳng hạn như nitrat và phosphat (Taylor & Francis Group, 2006).
1.9.3.1. Chuẩn bị dung dịch stock
Môi trường thường bao gồm ba thành phần: chất dinh dưỡng, nguyên tố vi lượng và các vitamin, cả ba thường được chuẩn bị như dung dịch stock. Dung dịch stock là một lượng từ 100 ml đến 1 lít thường được chuẩn bị ở nồng độ chất dinh dưỡng từ 100 đến 1.000 lần. Dung dịch stock hữu ích với một số nguyên nhân như: hạn chế được sai số, tiết kiệm thời gian và nó cung cấp một nguồn đơn giản và thống nhất. Khi pha dung dịch stock cần khuấy liên tục, nếu có nhiều thành phần trong một dung dịch stock cần hòa tan hoàn toàn thành phần này trước khi thêm thành phần tiếp theo. Dung dịch stock cần được lưu trữ trong bình thủy tinh đậy kín để tránh thay đổi nồng độ ban đầu do bay hơi. Khi không sử dụng cần để dung dịch stock trong tủ lạnh (4°C) hoặc đông lạnh. Cần lưu ý là dung dịch stock phosphate không bao giờ được lưu trữ trong các chai nhựa tổng hợp vì ion phosphate hấp thụ mạnh mẽ vào polyethylene (Hassenteufel et al., 1963). Dung dịch stock silicat không được lưu trữ trong vật liệu thủy tinh do hòa tan axit silixic từ thủy tinh. Trong trường hợp của kim loại như là sắt, coban, đồng, mangan, kẽm, đun sôi trong 5 đến 10 phút để thúc đẩy tiến trình hòa tan (Taylor & Francis Group, 2006).
1.9.3.2. Vitamin
Thông thường, ba loại vitamin-vitamin B12 (cyanocobalamin), thiamine, và biotin được thêm vào, nhưng rất ít tảo cần cả ba loại vitamin (Provasoli và Carlucci, 1974). Trình tự chung của các yêu cầu vitamin cho tảo là vitamin B12 > thiamine > biotin. Hầu hết các loài chỉ cần một hoặc hai vitamin. Vitamin thường được thêm vào môi trường sau khi đã được hấp vô trùng (thông qua một bộ lọc 0,2 mm). Nếu hấp khử trùng có thể gây phân hủy của một số vitamin, nhưng người ta cho rằng một số loại tảo có thể sử dụng một số các sản phẩm phân hủy (Provasoli và Carlucci, 1974). Stock Vitamin có thể được đông lạnh trong thời gian dài mà suy thoái không đáng kể, và các stock có thể được làm lạnh lại sau mỗi lần sử dụng. Ba stock vitamin có thể được kết hợp thành một dung dịch duy nhất với nồng độ pha loãng 1000 lần (Andersen, 2004).
1.9.4. Phương pháp khử trùng
Khử trùng là cách hiệu quả và phổ biến nhất đối với vật liệu chịu nhiệt và chất lỏng. Nồi hấp là thiết bị khử trùng được sử dụng rộng rãi. Thời lượng hấp phụ thuộc vào khối lượng của chất lỏng được vô trùng. Ví dụ, để khử trùng ống nghiệm có đường kính 18 mm hấp 10 phút ở 121°C là đủ, trong khi đó để khử trùng 10 lít chất lỏng thì cần 1 giờ. Khử trùng môi trường nuôi thường được thực hiện ở 121°C để 15 phút, sau một thời gian làm nguội, môi trường nuôi cần được kiểm tra, nếu màu sắc đã thay đổi hoặc nếu có kết tủa hình thành thì môi trường có thể không thích hợp để sử dụng bình thường. Khi hoạt động đúng cách, một nồi hấp giết chết tất cả các vi sinh vật, thậm chí cả bào tử chịu nhiệt của vi khuẩn và nấm. Khi khử trùng chất lỏng, nên để lại một khoảng trống trong thùng chứa (ví dụ, bình và ống nghiệm) ít nhất là một phần tư tổng khối lượng để đảm bảo không gian cho hơi nước tồn tại khi đun sôi. Trước khi nồi hấp bắt đầu, phải đảm bảo nước trong nồi hấp là đủ để đảm bảo sản xuất hơi trong suốt quá trình khử trùng. Sau khi hoàn thành quá trình khử trùng, các nắp nồi hấp không được mở ngay. Mở nồi hấp sớm rất nguy hiểm và có thể gây ô nhiễm từ các bào tử trong không khí xung quanh phòng lưu thông bởi dòng đối lưu vào nồi hấp. Tuy nhiên, một môi trường nuôi cấy lỏng không nên để cho nguội với nhiệt độ phòng trong nồi hấp, bởi vì điều này thường dẫn đến sự hình thành của kết tủa. Đặc biệt là khi khử trùng nước biển hoặc một môi trường nuôi cấy có chứa silicat, cần nhanh chóng làm mát ngoài nồi hấp để giảm thiểu sự hình thành kết tủa (Cost et al., 1989).
Khử trùng bằng cách lọc là cần thiết đối với thành phần không ổn định nhiệt, như vitamin, hoặc các thành phần chất lỏng dễ bay hơi, chẳng hạn như các dung môi hữu cơ. Các bộ lọc cần phải có kích thước lỗ nhỏ hơn 0,2 mm, tuy nhiên, quan trọng là phải lưu ý rằng vi rút có thể đi qua đó bộ lọc. Khi dung dịch có độ nhớt cao hoặc có chứa các hạt lơ lững, thiết bị lọc với kích thước lỗ 1mm là cần thiết (Andersen, 2005).
Tia bức xạ UV thích hợp đối với sử dụng phòng thí nghiệm để khử trùng các thiết bị nuôi, nắp ống và băng ghế. Tia bức xạ UV gây tổn hại cho con người (đặc biệt là đôi mắt) nên cần phải chăm sóc và tránh tiếp xúc. Ngoài ra, bức xạ tia cực tím tạo ra ozone gây sự khó chịu (Hamilton, 1973). Bức xạ tia cực tím có hiệu lực gây chết tại 260 nm, tác động vào các liên kết cộng hóa trị thymines liền kề trong DNA. Những thymine-thymine nhị trùng lần lượt gây ra lỗi sao chép DNA, từ đó gây ra đột biến và có khả năng gây chết (Andersen, 2005).
1.9.5. Phương pháp phân lập
Phương pháp được thiết lập, bắt đầu bằng công việc của Beijerinck (1890) và Miquel (1890-1893). Một số loài rất dễ phân lập và nuôi cấy, trong khi một số loài khác rất khó hoặc dường như không thể phát triển (Andersen, 2004). Thời gian là một yếu tố quan trọng đối với phân lập tảo. Một số sinh vật chết một cách nhanh chóng, thậm chí trong vòng 1 hoặc một vài giờ sau khi lấy mẫu. Đối với những sinh vật này, cô lập phải được tiến hành nhanh chóng. Tăng cường độ ánh sáng thường không tăng tốc độ tăng trưởng cho các tế bào phân lập, và trong nhiều trường hợp điều này là có hại (ví dụ, đối với nhiều tảo silic sống ở đáy). Thông thường, bước đầu tiên để cô lập thành công là sự hiểu biết và bắt chước điều kiện môi trường tự nhiên. Đối với tảo biển ven biển, nhiệt độ và độ mặn là quan trọng, với tảo nước ngọt thu thập được trong những tháng không lạnh thường ít nhạy cảm với nhiệt độ. Sự hiểu biết về các loài mục tiêu rất quan trọng. Tảo silic thường yêu cầu silica, euglenoids yêu cầu amoniac, và một số chi (ví dụ, Chrysochromulina) cần selen. Loài Mixotrophic thường yêu cầu một nguồn thức ăn do vi khuẩn và Pfiesteria có thể yêu cầu thức ăn có nguồn gốc nhân chuẩn. Bước thứ hai hướng cô lập thành công liên quan đến việc loại bỏ các chất gây ô nhiễm. Bước cuối cùng yêu cầu tiếp tục tăng trưởng khi cấy truyền, hay nói cách khác là chuẩn bị được môi trường nuôi phù hợp (Andersen, 2005).
Làm giàu môi trường nuôi đã được sử dụng như một giai đoạn trong việc phân lập đơn bào. Chúng được thành lập bằng cách thêm các chất dinh dưỡng cho các mẫu tự nhiên,
làm phong phú thêm các mẫu để tảo có thể phát triển. Các chất làm giàu, thường là nitrat, phosphate, hoặc đất nước chiết xuất. Khi các loài mục tiêu đáp ứng với môi trường làm giàu thì sự phân lập trở nên dễ dàng và thành công hơn. Ngoài ra, kết hợp các chất dinh dưỡng (ví dụ, nitrat và silica cho sự phát triển tảo silic) hoặc hoàn chỉnh môi trường nuôi có thể được bổ sung cho phù hợp với loài mục tiêu. Hơn nữa, một số sinh vật không quan sát thấy ở mẫu ban đầu đôi khi xuất hiện 7 đến 10 ngày sau đó. Các chất bổ sung vào làm giàu môi trường không nhiều, thường ở mức tối thiểu, chỉ một phần ngàn của môi trường nuôi được thêm vào (Andersen, 2005).
1.10. Vai trò của vi tảo 1.10.1. Lợi ích 1.10.1. Lợi ích
Tảo nói chung và vi tảo nói riêng có vai trò rất quang trọng trong tự nhiên và trong đời sống nhân loại (Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Hoài Hà, 2006). Sản lượng hàng năm của chúng tạo ra cao hơn nhiều so với cây trồng trên mặt đất, ví dụ: nếu đào ao nuôi tảo năng suất có thể đạt 20-30 tấn/ha. Đối với tăng trưởng của chúng, vi tảo yêu cầu tương đối ít chất dinh dưỡng vô cơ, mà thậm chí còn được coi là chất thải nông nghiệp hoặc công nghiệp, chẳng hạn như CO32-, NO3- và PO42- (Andersen, 2005).
Trong vi tảo có nhiều hợp chất hữu ích như protein, carbohydrate, acid béo, chất chống oxy hóa, phytohormones, bột màu và các vitamin. Các hợp chất này có giá trị cao tạo cho vi tảo là thành phần hoàn hảo trong nhiều thức ăn và các ứng dụng thực phẩm (Antonie Martinus, 1971).
Nhiều tảo biển còn khai thác để sản xuất thạch (agar), alginate, sản phẩm giàu iod... Nhiều tảo đơn bào được nuôi trồng công nghiệp để tạo ra những nguồn thức ăn cho ngành nuôi tôm hay thuốc bổ trợ giàu protein, vitamin và vi khoáng dùng cho người. Một số vi tảo được dùng để sản xuất carotenoid, astaxanthin, các acid béo không bão hòa... Tảo silic tạo ra các mỏ diatomid, đó là loại nguyên liệu xốp, nhẹ, mịn được dùng trong nhiều ngành công nghiệp. Dạng tảo cộng sinh với nấm thành Địa y cũng là dạng phân bố rất rộng rãi và nhiều loài đã được khai thác dùng làm dược phẩm, nước hoa, phẩm nhuộm và các mục đích kinh tế khác (hiện đã biết tới 20 000 loài Địa y thuộc 400 chi khác nhau) (Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Hoài Hà, 2006).
Trong các thủy vực nước ngọt tảo silic là thành phần chính của năng suất sơ cấp. Trong các biển và đại dương tảo silic chiếm ưu thế cả về sinh khối lẫn thành phần loài. Hàng năm thực vật phù du (mà chủ yếu là tảo silic tạo ra tới 19 tỷ tấn chất hữu cơ, nuôi sống được tới 5 tỷ tấn động vật không xương sống. Nhiều tính toán cho kết quả còn cao hơn nữa. Tảo silic đóng vai trò chủ đạo trong việc tạo nên các năng suất sơ cấp trong hệ sinh thái biển, nhất là những vùng không được tiếp nhận nguồn thức ăn hữu cơ mang tới từ các dòng lục địa (E. F. Stoermer and John P. Smol, 2004).
Qua nhiều thế kỷ xác của tảo silic tạo nên các các mỏ diatomid lớn do cấu trúc silic của nắp vỏ xác tảo silic không bị phân hủy. Diatomid có tính chất nhẹ, xốp, cách điện, trơ với acid... cho nên đã được ứng dụng rộng rãi để chế tạo các sản phẩm cách điện, cách nhiệt, chất đệm trong thuốc nhuộm, trong xà phòng, sản xuất thủy tinh lỏng, làm nền khi điện di chiết tách dược phẩm, ...Các tầng diatomid còn là cơ sở để xác định tuổi của các địa tầng và lịch sử của vỏ Trái đất từ cuối kỷ Jura cho đến nay (Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Hoài Hà, 2006).
Nhiều loài của giống Nitzschia được công nhận như các chỉ số ô nhiễm hữu cơ hay làm giàu của nước (Lowe, 1974; Cholnoky,1968). Nhiều loài Nitzschia tận dụng các phân tử nitơ hữu cơ trong nước. Do đó, chúng được tìm thấy nhiều nhất ở nơi có đạm hữu cơ dồi dào, các khu vực nước bị ô nhiễm hữu cơ. Nitzschia palea là một trong những loài phổ biến được tìm thấy ở các khu vực ô nhiễm hữu cơ (Palmer, 1969). Tuchman (1996) báo cáo rằng
Nitzschia palea đã có thể sử dụng 21 chất hữu cơ khác nhau (John D.Wehr and Robert G.Sheath, 2003).
Giống như tất cả các sinh vật khác, vi tảo tham gia vào chu trình sinh địa hóa. Đặc biệt, tảo rất quan trọng đối với chu trình sinh địa hoá của các nguyên tố hóa học mà chúng hấp thu, đồng hóa, và sản xuất, chẳng hạn như oxy, carbon, nitơ, phốt pho, silic, và lưu huỳnh (Taylor & Francis Group, 2006).
Vi tảo có vai trò trong việc phân tích các vấn đề sinh thái như: biến đổi khí hậu, axit hóa, và hiện tượng phú dưỡng (E. F. Stoermer and John P. Smol, 2004).
1.10.2. Tác hại
Thực vật phù du không chỉ là nguyên nhân của cuộc sống dưới nước mà đôi khi chúng còn gây ra cái chết cho nhiều sinh vật khác. Khi số lượng tế bào trở nên quá lớn để đáp ứng với tình trạng ô nhiễm, với chất dinh dưỡng như nitơ và phốt phát, tảo nở hoa có thể làm giảm độ trong suốt của nước làm chết nhiều động vật khác. Chúng có thể sản xuất ra chất độc và độc tố làm chết cá lớn và gia cầm (Taylor & Francis Group, 2006).
Tảo silic cũng góp phần tạo nên hiện tượng “nước nở hoa” làm hư hỏng nguồn nước sạch (Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Hoài Hà, 2006). Số lượng tảo nở hoa có thể từ hàng trăm đến hàng ngàn tế bào/ml, thậm chí có thể lên đến hàng triệu tế bào/ml. Tảo nở hoa thường có màu xanh, màu vàng nâu hoặc màu đỏ tùy thuộc vào các loài tảo. Khi tảo nở hoa có thể gây chết cho động vật có vỏ sống ở đáy, gây chết cá do xương mang bị tắc bởi chất nhầy