Phƣơng pháp đƣợc sử dụng để tinh sạch protein, xác định trọng lƣợng phân tử và phân tích định lƣợng tƣơng tác phân tử.
Hình 2.4. Tách các phân tử bằng lọc gel
Một số thông số vật lý của phƣơng pháp
Giới hạn tách (exclution limit): là kích thƣớc của phân tử nhỏ nhất không
chui vào bên trong hạt gel, nhƣ vậy tất cả chúng sẽ tách cùng một lƣợt ra khỏi cột. Thí dụ giới hạn tách của G-50 có phạm vi tách từ 1.500-30.000 Da, có nghĩa là các phân tử lớn hơn đều không chui vào hạt gel.
Phạm vi tách (Fructionation range): Thí dụ sephadex G-50 có phạm vi tách
từ 1.500-30.000 Da.
Độ ngậm nước (water regain): Là trọng lƣợng nƣớc mà 1 gam bột gel khô
hút nƣớc. Thí dụ G-50 có độ ngậm nƣớc là 5,0 0,3 g. Giá trị này chƣa tính đến lƣợng nƣớc bao quanh hạt. Do vậy không thể sử dụng nó để tính thể tích của cột.
Thể tích nền (bed volume): là thể tích cuối cùng mà 1 gam gel khô hấp thu
khi trƣơng nở trong nƣớc. G-50 có thể tích nền 9-11 ml/g gel khô.
Hạt gel (Gel particle): Hạt gel hình cầu có nhiều lỗ. Kích thƣớc hạt xác định
bằng mesh hoặc đƣờng kính hạt (bead diameter) tính theo m. Hạt có kích thƣớc lớn (50-100 mesh, 100-300 m cho tố độ dòng chảy qua cột cao, nhƣng kết quả tách thấp. Ngƣợc lại những hạt mịn (400 mesh, 10-40 m) lại cho tốc độ dòng chảy qua cột nhỏ, tách cũng không tốt. Thƣờng ngƣời ta chọn hạt gel có kích thƣớc 100- 200 mesh (50-150 m).
Thể tích trống (void volume): Là tổng thể tích không gian bao quanh hạt gel
trong cột. Xác định nhờ chất màu blue dextran có trọng lƣợng phân tử 2.000.000 Da.
Thể tích thổi (elution volume): là thể tích đệm cần thiết để rửa thổi chất cần
tách ra khỏi cột.
Đặc tính hóa học của gel
Có 4 loại gel thƣờng đƣợc sử dụng.
Dextran: Có bản chất là polysaccharide tự nhiên do hãng Pharmacia (Thụy Điển) cung cấp với tên thƣơng mại là Sephadex. Giới hạn tách của gel dextran 600.000 Da. Tuy nhiên nếu dextran đƣợc bổ sung thêm các liên kết ngang bởi N,N’- methylene bisacrylamide thì dextran có giới hạn tách gia tăng.
Gel polyacrylamide: Tạo bởi quá trình đồng polymer hoá của acrylamide và N,N’-methylene bisacrylamide (Bio-Rad cung cấp – Biogel –P là tên thƣơng mại)
Gel agarose: Là thành phần polysaccharide tự nhiên của agar, cấu tạo từ galactose và anhydrogalactose. Mạng gel đƣợc ổn định nhờ liên kết hydro nhiều hơn là do các liên kết ngang. Hãng Bio-Rad cung cấp agarose với tên thƣơng mại là Bio-gel A..
Gel kết hợp polyacrylamide và agarose có tên thƣơng mại là ultragel, nó cho phép có độ phân tách cao với cấu trúc khá vững của agarose cho phép sử dụng áp suất để tách.