a). Ưu điểm
Sắc ký lọc gel là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện trên các phân tử sinh học mẫn cảm với sự thay đổi về pH, nồng độ của ion kim loại hoặc các chất đồng tác động (cofactor) và các điều kiện môi trƣờng khắc nghiệt.
Sự phân tách có thể đƣợc thực hiện khi có sự hiện diện của các ion hoặc các cofactor thiết yếu, các chất tẩy (detergents), urea, guanidinehydrocloride, ở cƣờng độ ion cao hoặc thấp, ở 370C hay trong phòng lạnh tùy theo những yêu cầu của thí nghiệm.
Kỹ thuật này cho phép thu lại lƣợng mẫu lớn, tách các phân tử có cùng pI và dễ dàng khử muối.
b). Nhược điểm
Chậm (tốc độ thấp - thời gian dài)
Yêu cầu các cột có kích thƣớc lớn tƣơng đối so với lƣợng mẫu.
Sự phân tách dựa trên sự khác nhau về kích thƣớc phân tử, thƣờng khó đạt đƣợc sản phẩm tinh khiết hoàn toàn. Vì lý do này, sắc ký lọc gel thƣờng đƣợc sử dụng với những kỹ thuật khác nhau nhƣ sắc ký trao đổi ion hay sắc ký hấp phụ.
2.4. XÁC ĐỊNH TRỌNG LƯỢNG PHÂN TỬ BẰNG ĐIỆN DI SDS-PAGE
Sau khi thực hiện các bƣớc ly trích và tinh sạch enzyme bƣớc kế tiếp kiểm tra lại độ tinh sạch protein dựa vào kỹ thuật điện di. Kỹ thuật điện di có thể cho ta xác định đƣợc trọng lƣợng phân tử protein mong muốn.
Kỹ thuật điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS, đây là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ thuật này protein đƣợc xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là mercaptoethanol hoặc dithiotheitol (DTT). Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 đƣợc biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các
protein đều đƣợc tích điện âm. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thƣớc, những phân tử có kích thƣớc lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thƣớc nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thƣớc nhất định. Dƣới tác dụng của điện trƣờng các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dƣơng và các phân tử tích điện dƣơng sẽ di chuyển về cực âm của điện trƣờng.
Để xác định phân tử lƣợng của một protein, ngƣời ta thƣờng so sánh với một thang phân tử lƣợng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lƣợng phân tử khác nhau đã biết.
Để đƣa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, ngƣời ta thƣờng sử dụng phƣơng pháp điện di trên gel không liên tục (discontinuous gel). Trong phƣơng pháp này gel gồm 2 lớp:
Lớp gel gom (stacking gel) (lớp trên): duỗi thẳng các phân tƣ̉ protein trong mẫu có cấu trúc bâ ̣c cao về da ̣ng cấu trúc bâ ̣c 1 và các protein này đƣợc dồn lại và tạo một lớp băng mỏng.
Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dƣới): tạo ra các băng protein có trọng lƣợng phân tử, kích thƣớc khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu.
Hai lớp gel này đƣợc phân biệt nhau bởi dung dịch đệm, nồng độ acrylamide và vị trí. Kỹ thuật SDS-PAGE có thể xác định đƣợc những phân tử protein có trọng lƣợng phân tử từ 10.000 - 200.000 Da Những phân tử protein có trọng lƣợng lớn hơn 200.000 Da thƣờng đƣợc xác định trên gel có nồng độ acrylamide ít hơn 2,5%.
Ngoài kỹ thuật SDS-PAGE là phƣơng pháp điện di trong điều kiện làm biến tính protein (Denaturing condition), ngƣời ta còn dùng một số kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khác nhằm phân tích protein trong điều kiện không biến tính (Nondenaturing condition) không có sự hiện diện của SDS hoặc để khắc phục một số vấn đề về SDS gây ra một số ảnh hƣởng đến đặc tính của protein nhƣ tạo liên kết (cross- linked) giữa các protein với nhau. Một số protein không có sự tỷ lệ giữa điện tích và khối lƣợng với những protein khác ngƣời ta sử dụng kỹ thuật điện di tập trung điểm đẳng điện (Isoelectric focussing gel electrophoresis).
2.5. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG XÚC TÁC CỦA ENZYME
Ngƣời ta xác định khả năng xúc tác của enzyme thông qua việc xác định hoạt tính hoạt động của enzyme. Ngƣời ta cũng không thể định lƣợng enzyme trực tiếp mà phải xác định gián tiếp thông qua hoạt tính hoạt động của chúng hoặc thông qua khả năng làm giảm cơ chất sau một thời gian phản ứng.
Bảng 2. 1. Nội dung các nhóm phƣơng pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme
Một số phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein trong dung dịch với độ nhạy của chúng khác nhau, hoặc do dựa vào sự có mặt của một số amino acid, do thành phần amino acid của protein khác nhau là khác nhau, nên kết quả phân tích sẽ bị ảnh hƣởng. Có 5 phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein trong dung dịch, trong đó 3 phƣơng pháp cổ điển, 2 phƣơng pháp hiện đại. Trong 5 phƣơng pháp thì 4 phƣơng pháp dựa vào phản ứng hoá học, 1 phƣơng pháp đo quang phổ.
2.5.1. Phƣơng pháp Biuret
Peptide và đặc biệt protein chứa từ 2 liên kết peptide trở lên đều có khả năng tạo phức cho màu mận chín với dịch kiềm chứa CuSO4 (nhờ liên kết coordinate –
Nhóm
phƣơng pháp Các thông số cố định Các thông số thay đổi
1 Thời gian
Nồng độ enzyme
Biến đổi của cơ chất và của sản phẩm
2 Lƣợng cơ chất mất đi ( hay lƣợng sản phẩm tạo thành) Nồng độ enzyme
Thời gian
3 Thời gian, lƣợng cơ chất mất đi hay lƣợng sản phẩm tạo thành
càng cua của N tham gia liên kết peptide với Cu+2). Hàm lƣợng của chúng (peptide & protein) tỷ lệ với độ đậm của màu.
Ngƣời ta thƣờng sử dụng albumine bò (bovine serum albumin) để dựng đƣờng chuẩn và đo ở bƣớc sóng 540 nm, đối chứng là dịch biuret và đệm hoặc nƣớc. Có một số tác nhân gây cản trở: đệm chuẩn bị từ amino acid, đệm Good’s, đệm Tris. Phƣơng pháp biuret có ƣu điểm là cho cùng kết quả ổn định đối với các loại protein khác nhau, dễ dàng thực hiện. Nhƣợc điểm chủ yếu là độ nhạy kém (1 mg).
2.5.2. Phƣơng pháp Lowry
Là phƣơng pháp khá nhạy (5 g). Đây là phƣơng pháp tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp biuret bổ sung thêm chất Folin-ciocalten làm tăng độ màu của dung dịch, nhƣ vậy dịch màu xanh dƣơng xuất hiện là do:
- Liên kết càng cua giữa N tạo liên kết peptide với Cu+2
- Sự khử chất Folin-ciocalten do tysosine và tryptophan trong phân tử protein tạo ra.
Các bƣớc thực hiện giống nhƣ phƣơng pháp biuret, độ nhạy cao hơn 100 lần. Tuy nhiên nó bị ảnh hƣởng rất mạnh bởi đệm Good’s, NH4)2SO4 (nồng độ >15%), glycine (nồng độ >0,5%) và mercaptan. Ngoài ra protein có hàm lƣợng tysosine và tryptophan khác nhau do vậy kết quả không mấy ổn định.
2.5.3. Phƣơng pháp Bradford
Do hạn chế trên ngƣời ta đã có cải tiến khắc phục bằng cách sử dụng chất màu liên kết với protein (Bradford, 1976, Biorad, 1984). Chất màu Coomassie gắn với protein trong dung dịch có tính acid sẽ làm thay đổi đỉnh hấp phụ từ bƣớc sóng 465 nm (của Coomassie) lên bƣớc sóng 595 nm liên kết với protein.Thƣờng sử dụng globulin hoặc albumin máu bò làm protein chuẩn. Phép đo rất tiện vì chỉ sử dụng một loại chất. Màu xuất hiện trong gần 2 phút và ổn định trong gần 1 giờ. Độ nhạy của phƣơng pháp cao ( 1-20 g), đôi khi nhạy hơn cả phƣơng pháp Lowry,
phƣơng pháp Bradford cũng cho kết quả khác biệt với các loại protein khác nhau. Nó chỉ bị ảnh hƣởng bởi triton X-100, sodium dodecyl sulfate.
Hình 2.6. Công thức cấu tạo chất màu Coomassie. 2.5.4. Phƣơng pháp BCA [Bicinchoninic Acid] (1985)
Phƣơng pháp này tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp Biuret và Lowry. Phân tử protein tƣơng tác với ion Cu+2 tạo ra Cu+1
, ion này sẽ tạo phức với bicinchoninic acid làm thay đổi màu táo xanh của BCA thành màu mận chín đỏ ở bƣớc sóng 562 nm. Phƣơng pháp này nhạy tƣơng đƣơng phƣơng pháp Lowry và Bradford. Ƣu điểm chính của nó là đơn giản và không bị triton và sodium dodecyl sulphate cản trở.
2.5.5. Phƣơng pháp đo phổ
Chủ yếu là nhờ sự có mặt của tyrosine và tryptophan nên dịch protein hấp thu ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng 280 nm. Tất nhiên là đối với protein có hàm lƣợng….khác nhau, kết quả hấp thu sẽ không giống nhau. Tuy nhiên đây là phƣơng pháp rất nhanh, đơn giản. Dịch tế bào chứa nhiều chất cũng hấp thu ở bƣớc sóng này do vậy chúng cũng là tác nhân cản trở phép đo, chủ yếu là nucleic acid. Để khắc phục ngƣời ta sử dụng tỷ lệ hấp thu A 280/A 260 để xác định hàm lƣợng protein, công thức thực nghiệm cho phép xác định hàm lƣợng protein trong dung dịch chứa tới 20% nucleic acid.
Phƣơng pháp này có ƣu điểm là xác định nhanh, chỉ yêu cầu một lƣợng mẫu nhỏ, so với phƣơng pháp so màu nó không bị ảnh hƣởng bởi phần lớn đệm và (NH4)2SO4. Đặc biệt nó thƣờng đƣợc sử dụng để phát hiện các peak chứa protein trong phƣơng pháp sắc ký cột.
Chƣơng 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
Thời gian tiến hành đề tài ngày 12/03/2007 đến ngày 20/07/2007 tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới.
3.2. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU
3.2.1. Vật liệu
Mẫu đầu và nội tạng tôm sú đƣợc phân tách từ tôm sú sống, loại 40 - 50 con/kg đƣợc nuôi ở Cần Giờ. Tôm đƣợc chở trong thùng sục khí về phòng thí nghiệm, rửa sạch và giết chết bằng cách trộn với nƣớc đá vụn, tỷ lệ tôm /đá là 1:3, sau đó tách lấy đầu hoặc nội tạng. Đầu và nội tạng đƣợc tách riêng 20 cái/bao nylong đƣợc bảo quản trong tủ đông sâu -20oC để sử dụng dần trong thí nghiệm, thời gian bảo quản không quá 4 tuần.
3.2.2. Hóa chất
Hóa chất pha đệm Tris-HCl 0,05 M pH 7,5.
Hóa chất pha đệm phosphate: muối NaH2PO4.2H2O và muối Na2HPO4.12H2O.
Muối sinh lý. Cát thạch anh.
Hóa chất tủa protein: Cồn 96o, acetone, muối (NH4)2SO4.
Hóa chất để xác định hàm lƣợng protein: Dung dịch albumin chuẩn 1mg/ml, thuốc thử Bradford (Coomasie Brilliant Blue, Ethanol tuyệt đối, Acid Phosphoric)
Hóa chất để xác định hoạt tính enzyme: Dung dịch Tyrosine 1mg/ml; HCl 0,1M; Na2CO3 0,4M; dung dịch Trichloacetic acid 0,4M (TCA); thuốc thử Folin; dung dịch đệm phosphate 0,1M; casein dạng bột.
Hóa chất dùng trong sắc ký lọc gel. Hóa chất dùng trong điện di SDS-PAGE.
3.2.3. Thiết bị
Máy đo quang phổ UV – Vis.
Máy khuấy từ.
Thiết bị lọc hút chân không. Máy ly tâm.
Máy đo pH. Cân phân tích. Bể ổn nhiệt, tủ sấy.
Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad gồm phễu đổ gel, flow adaptor, vòi hút chân không để khử khí cho dung dịch.
Cối inox nghiền mẫu. Ống nghiệm.
Bình định mức, ống đong. Phễu lọc, giấy lọc, đũa khuấy.
Pipette thủy tinh, pipetman 100 – 200 l, 100 – 1000 l
Các dụng cụ để chạy điện di: Bộ điện di dứng, bộ nguồn chạy điện di, đầu típ, eppendorf, phao để eppendorf.
3.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐÃ ÁP DỤNG
Xác định hoạt tính của protease từ mẫu đầu và nội tạng tôm sú theo phƣơng pháp Amano (Phụ lục 1_chƣơng 3).
Xác định hàm lƣợng protein hòa tan theo phƣơng pháp Bradford (Phụ lục 2_chƣơng 3).
Tinh sạch enzyme bằng phƣơng pháp sắc ký lọc gel áp suất thấp (Phụ lục 3_chƣơng 3).
Xác định trọng lƣợng phân tử bằng phƣơng pháp điện di SDS-PAGE (Phụ lục 4_chƣơng 3).
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Chiết rút thu dịch chiết protease nội tạng và đầu tôm sú
Xay đầu tôm trên cối xay thịt, nghiền nhuyễn bằng cối inox với cát thạch anh đã xử lý và làm sạch. Nội tạng chỉ nghiền. Dùng dung môi (nƣớc cất, dung dịch muối sinh lý, đệm phosphate, đệm Tris-HCl) với các tỷ lệ khác nhau, khuấy đảo liên tục ở điều kiện nhiệt độ 0 - 4oC trong 40 phút để chiết rút enzyme, ly tâm lạnh ở 4oC, tốc độ 6.000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ phần cặn, thu dịch chiết (DC). Khảo sát ảnh hƣởng tỷ lệ dung môi và loại dung môi chiết với mẫu. Từ đó chọn dung môi và tỷ lệ thích hợp chiết enzyme.
3.4.2. Thu nhận chế phẩm protease
Sử dụng các tác nhân gây kết tủa thuận nghịch protein trong dịch chiết nội tạng và đầu tôm là: cồn 96o, acetone và muối sulfate amon.
Tiến hành tủa DC bằng các tác nhân trên với tỷ lệ DC/dung môi khác nhau ở điều kiện 0 – 4o
C, thời gian tủa 60 phút, ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 15 phút – thu cặn là chế phẩm enzyme thô (CPT). Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ tủa và tác nhân tủa từ đó chọn ra tác nhân và nồng độ thích hợp để tủa DC thu protease.
3.4.3. Bố trí thí nghiệm
Quy trình tách chiết, tinh sạch và khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng hoạt động của protease từ mẫu đầu và nội tạng tôm sú đƣợc tiến hành theo sơ đồ bố trí nhƣ sau
Tôm sú (đầu hoặc nội tạng) Nghiền mịn Chiết dịch enzyme thô
Ly tâm dịch chiết enzyme thô Dịch chiết enzyme thô (DC)
Tủa dịch chiết
Ly tâm thu chế phẩm thô Chế phẩm thô (CPT) Xác định trọng lƣợng phân tử bằng điện di SDS-PAGE Tinh sạch bằng sắc ký lọc gel Xác định hoạt tính protease Xác định hàm lƣợng protein Xác định hoạt tính protease Xác định hàm lƣợng protein Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng
đến hoạt động của enzyme CPT: nhiệt độ, pH, % muối ăn. Xác định hoạt tính protease Xác định hàm lƣợng protein
3.4.3.1. Xác định dung môi và chế độ tách chiết protease từ nội tạng và đầu tôm sú thích hợp đầu tôm sú thích hợp
Dung môi chiết có ảnh hƣởng đến hoạt tính của enzyme. Tiến hành chiết tách protease từ mẫu nội tạng và đầu tôm sú bằng các dung môi: nƣớc cất, muối sinh lý, đệm phosphate 0,1M pH 7,0 và đệm Tris-HCl 0,05M pH 7,5 cùng với các tỷ lệ khối lƣợng mẫu/dung môi (w/v) khác nhau, đƣợc giữ ở ≤ 4oC bằng đá vụn, khuấy liên tục trên mấy khuấy từ trong 40 phút. Ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 15 phút, thu DC.
Nƣớc cất: tỷ lệ mẫu/dung môi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5.
Nƣớc muối sinh lý: tỷ lệ mẫu/dung môi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5.
Đệm phosphate 0,1M pH 7,0: tỷ lệ mẫu/dung môi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7; 1/8; 1/9; 1/10.
Đệm Tris-HCl 0,05M pH 7,5: tỷ lệ mẫu/dung môi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7; 1/8; 1/9; 1/10.
Xác định hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của từng DC, so sánh, chọn ra tỷ lệ chiết thích hợp và loại dung môi chiết thích hợp. Sơ đồ bố trí TN nhƣ sau:
Nội tạng tôm sú (đã nghiền)
Hòa với các dung môi
Nƣớc cất Tỷ lệ 1/1-5 (w/v) Muối sinh lý Tỷ lệ 1/1-5 (w/v) Đệm phosphate Tỷ lệ 1/1-10 (w/v) Tris-HCl Tỷ lệ 1/1-10 (w/v) (w/v) Xác định hoạt tính proetease của DC
Xác định hàm lƣợng protein của DC Chọn ra dung môi và tỷ lệ chiết thích hợp
Đầu tôm sú (đã nghiền)
3.4.3.2. Xác định tác nhân tủa thích hợp và nồng độ thu CPT từ DC
Mỗi loại tác nhân tủa thƣờng có khả năng làm kết tủa protein-enzyme ở những nồng độ khác nhau và có ảnh hƣởng đến hoạt tính enzyme sau khi kết tủa. Tiến hành tủa protein-enzyme từ DC bằng các tác nhân với các nồng độ trong thời gian 60 phút, ở nhiệt độ ≤ 4oC. Ly tâm lạnh 4oC, tốc độ 6.000 vòng/phút trong 15 phút thu cặn tủa (DCT). Hòa CPT với dung dịch đệm phosphate 0,1 M pH 7,0 đƣợc đƣa về cùng thể tích nhất định (một lƣợng ít nhất có thể).
Tủa bằng ethanol (cồn 96o) đƣợc làm lạnh, nồng độ tủa theo tỷ lệ DC/cồn (v/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7; 1/8.
Tủa bằng acetone đƣợc làm lạnh, nồng độ tủa theo nồng độ phần trăm (%):50; 55; 60; 65; 70; 75.
Tủa bằng muối (NH4)2SO4, nồng độ tủa theo nồng độ muối bão hòa (%): 50; 55; 60; 65; 70; 75.
Xác định hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của từng CPT, so sánh, chọn ra