trên thực vật bằng kỹ thuật RAPD
B. Moury và ctv (2000) đã sử dụng 250 primer RAPD phân tích 153 cá thể F2 của tổ hợp lai PI195301(mẩn cảm)xPI152225(kháng bệnh) đã xác định đƣợc 4 maker liên kết tính kháng bệnh héo đốm do virus trên tiêu (OPAC10-593bp, OPAH13-800bp, OPAF16-250bp, OPB01-750bp) [9].
Xác định maker liên kết tính kháng bệnh nấm vảy ở lúa mì (Guihong YU và ctv, 2003) [13]: Dùng 520 primer RAPD phân tích quần thể F7 của tổ hợp lai Ning894037 (kháng)xAlondra (mẩn cảm), Guihong đã xác định đƣợc 3 primer S1384, S1360, S1319 khuếch đại 4 band (640bp, 600bp, 350bp, 820bp) liên kết với tính kháng bệnh nầm vảy ở lúa mì.
Marker phân tử liên kết gene Vbj kháng bệnh nấm vảy trên táo bắt nguồn từ táo dại Malus baccata jackii (M Gygax và ctv, 2004) [15]: Quần thể 173 cá thể F2 từ tổ hợp lai A722-7× cv. Golden Delicious (A×GD) (Giống A722-7 mang gene Vbj kháng bệnh mấm vảy, còn giống Golden Delicious là giống mẩn cảm) đƣợc chọn ra 10 cây kháng và 10 cây bê ̣nh. Dùng 506 primer RAPD (10 nucleotide) để thƣ̣c hiê ̣n phản ứng PCR cho 20 cây này. M.Gygax và ctv đã xác định đƣợc 3 primer RAPD là: OPB08, OPK08, OP123 khuếch đại các band 710bp, 848bp, 869bp có hiện diện trong nhóm kháng và mẹ A722-7(có gene Vbj) nhƣng không hiện diện trong nhóm mẩn cảm và bố GD. Phân tích 173 cây con F2 của AxGD thì thấy 3 marker đã liên kết với gene Vbj có tần số liên kết là 16,2% - 22%.
Các nghiên cứu trong nƣớc chỉ dừng lại ở việc sử dụng các marker phân tử có sẵn để chọn giống. Tuy nhiên trong các nghiên cứu này thƣờng không dùng marker RAPD mà dùng các marker nhƣ SSR, RFLP, STS do marker RAPD không ổn định. Marker RAPD chỉ đƣợc ứng dụng trong nghiên cứu xác định các loại marker khác thông qua bảng đồ di truyền.
Chƣơng 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đánh giá đa dạng di truyền của các giống dứa Cayenne tại Tp. Hồ Chí Minh
3.1.1. Thời gian và địa điểm
Tiến hành từ tháng 2/2007 tới tháng 7/2007 tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực Vật (Viện Công nghệ Sinh Học và Môi Trƣờng, Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh).
3.1.2. Đối tƣợng
Các cây dứa Cayenne thuộc 3 giống Trung Quốc, Thái Lan, Lâm Đồng sạch bệnh virus đƣợc tạo bằng phƣơng pháp nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng (kết hợp xử lý nhiệt) cung cấp bởi Bộ môn CNSH (Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh).
3.1.3. Dụng cụ và thiết bị
Găng tay (Malaysia).
Máy ly tâm 14.000 vòng/phút (Hettich, Đức). Tủ sấy (Anh).
Tủ ủ mẫu (Anh).
Tủ – 20oC (Sanyo, Nhật). Nồi hấp autoclave (Nhật).
Máy điện di (Biorad, Thụy Điển và Cosmo Bio Co, Nhật). Máy vortex (Đức).
Tủ hút, tủ cấy vô trùng (Việt Nam / Anh). Máy chụp gel (Biorad, Thụy Điển). Giếng, lƣợc đổ gel.
Máy PCR PTC Thermocycle 100. Máy quang phổ UV – VIS. Cuvette.
3.1.4. Hóa chất
Hóa chất dùng cho tách chiết DNA tổng số từ lá dứa
Dung dịch phenol:chloroform:isoamylalcohol (PCI) (25 : 24 : 1). Dung dịch isopropanol lạnh.
Ethanol 96 % và ethanol 70 %.
Dịch tách chiết CTAB (2% CTAB, 1,4M NaCl, 100 mM Tris – HCl pH 8, 20mM EDTA, 0,1% Mercaptoethanol).
Dung dịch TE 1X (1M Tris – HCl, 0,5M EDTA). Nƣớc cất siêu sạch khử ion.
Hóa chất dùng cho kiểm tra DNA Agarose (BioRad).
Ethidium bromide. Loading dye. Nƣớc cất 2 lần.
Dung dịch TAE 0,5X (Tris acetat 40mM, EDTA 0,1mM, pH 8,0). Ladder 0,1 – 3 kb (Biorad).
Dung dịch TE 1X (1M Tris – HCl, 0,5M EDTA). Hóa chất dùng cho phản ứng PCR-RAPD
Bộ GoTaq polymerase (Promega) gồm: Taq polymerase, MgCl2 và Taq
buffer.
dNTPs mix (Promega).
32 Primer (10 nucleotide) (Promega).
Nƣớc (cất 2 lần rồi khử ion, hấp, chiếu tia UV).
3.1.5. Phƣơng pháp tiến hành
3.1.5.1. Ly trích DNA tổng số từ lá dứa
Chọn những cây dứa khỏe. Lấy khoảng 3-4 lá non, không lấy lá già, cắt bỏ phần ngọn, lau sạch rồi cho vào túi nilon đã ghi đầy đủ thông tin về mẫu và giữ mát trong thùng đá. Sau đó mẫu đƣợc đem giữ ở tủ –20oC tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá Sinh thuộc Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
Thực hiện ly trích theo quy trình của Dolye có cải tiến (1990).
Nghiền 0,5 g lá trong nitơ lỏng, cho bột mịn vào eppendorf 1,5 ml. Thêm 1 ml dung di ̣ch CTAB đã đƣợc đun nóng ở 650C.
Mẫu đƣơ ̣c ủ trong 1 giờ ở 650C. Ly tâm, chuyển phần dịch qua eppendorf mới.
Sau đó thêm vào 500 μl phenol/chloroform/isoamilalcohol (25:24:1), lắc nhẹ và đều.
Ly tâm trong 15 phút ở 11.000 vòng/phút.
Hút dịch nổi và tủa DNA bằng cách thêm vào isopropanol, để ở 40C trong 15 – 30 phút .
Rửa lại DNA bằng ethanol 700.
Ly tâm và để khô. Sau đó hòa trong dung dịch TE 1X. Bảo quản mẫu ở -200
C.
Đánh giá kết quả bằng điện di
DNA tổng số sau khi ly trích sẽ đƣợc đánh giá định tính bằng điện di trên gel agarose 1%. Sau khi điện di, gel sẽ đƣợc ngâm trong dung dịch ethidium bromide trong 10 phút sau đó đƣợc đƣợc chụp bằng máy chụp gel.
Cách tiến hành:
Pha dung dịch TAE 0,5X.
Pha gel agarose với nồng độ 1% (15 ml cho gel 6 và 8 giếng, 30ml cho gel 12 và 17 giếng). Đun bằng lò Viba 2 phút cho agarose tan thật đều.
Để nguội đến 50-550C, đổ vào khuôn, cài lƣợc vào. Chờ 30 phút để agarose đông.
Gở lƣợc ra rồi đặt bảng gel vào buồn điện di.
Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 1 μl loading dye và 4 μl DNA mẫu. Chạy điện di ở điều kiện 100 V, 400 mA, thời gian 20 phút.
Nhuộm ethidium bromide khoảng 10 phút (có mang bao tay).
Gel sau khi nhuộm sẽ đƣợc chụp bằng tia tử ngoại UV. Nếu mẫu có DNA thì band DNA sẽ phát sáng dƣới dạng vạch trên gel điện di. Độ tập trung và độ đậm
nhạt của band điện di phản ánh độ tinh sạch và nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA. Nếu địên di kiểm tra kết quả RAPD thì pha gel 2 % và điện di ở điều kiện 50 V, 400 A trong 60 phút.
Đánh giá kết quả bằng phƣơng pháp đo mật độ quang
Ngƣời ta tính tỉ lệ OD260/OD280 để ƣớc lƣợng độ tinh sạch của dung dịch nucleic acid. Nếu tỉ lệ này nằm trong khoảng 1,8 – 2,2 thì dung dịch acid nucleic đƣợc xem là sạch. Khi mẫu có lẩn protein hay phenol thì tỉ lệ này sẽ thấp hơn và mẫu DNA không đạt yêu cầu để thực hiện RAPD.
Một cách tổng quát, hàm lƣợng DNA đƣợc tính theo công thức:
Hàm lƣợng DNA (ng/µl) = [(62,9*OD260)-(36*OD280)] * Độ pha loãng
Phƣơng pháp tính gần đúng hàm lƣợng DNA bằng OD:
Xây dựng đƣờng chuẩn: dùng dung dịch TE 1X để tạo đƣờng chuẩn. Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thƣờng pha loãng 100 lần với dung dịch TE 1X: hút 20 µl dung dịch DNA hòa tan với 1,980 ml TE 1X).
Tiến hành đo OD ở 2 bƣớc sóng OD260, OD280.
Đối với một dung dịch DNA sợi đôi, sự hấp thụ ở bƣớc sóng 260 nm tăng lên khi phân tử DNA bị biến tính tức là khi hai sợi tách rời nhau. Ngƣời ta gọi đó là hiệu quả siêu sắc (hyperchromic effect).
Sau khi đo OD các mẫu DNA tổng số đƣợc pha loãng về nồng độ 50ng/μl để thực hiện phản ứng RAPD. Đây là nồng độ đƣợc cho là tối ƣu cho phản ứng RAPD.
3.1.5.2. Tối ƣu hoá phản ứng RAPD
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ Taq polymerase Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Bảng 3.1 Các nghiệm thức trong tối ƣu hoá nồng độ Taq polymerase
Hoá chất
Nồng độ
Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 PCR buffer dNTPs Primer Mg2+ Taq polymerase DNA mẫu Nƣớc cất 1X 0,2 mM 1 pm/ l 3 mM 0,5 U 50 ng Thêm vào cho đủ
25 l 1X 0,2 mM 1 pm/ l 3 mM 0,75 U 50 ng Thêm vào cho đủ
25 l 1X 0,2 mM 1 pm/ l 3 mM 1 U 50 ng Thêm vào cho đủ
25 l
Phƣơng pháp tiến hành: Chọn một mẫu DNA có chất lƣợng tốt, thực hiện phản ứng RAPD với nồng độ và các thành phần nhƣ bảng 3.3. Thực hiện Phản ứng RAPD theo chu trình nhiệt ở bảng 3.2.
Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng RAPD [16] Số chu kỳ Nhiệt độ (0 C) Thời gian 1 94 5 phút 45 94 30 giây 37 30 giây 72 1 phút 1 72 5 phút Giữ ở 40C
Chỉ tiêu đánh giá kết quả thí nghiệm: Độ sáng, rõ của các band trên gel agarose 2% sau khi tiến hành điện di 50V trong 60 phút.
Thí nghiệm 2 : Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ Primer Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Bảng 3.3 Các nghiệm thức trong tối ƣu hoá nồng độ primer.
Hoá chất
Nồng độ
Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 PCR buffer dNTPs 1.2 Primer Mg2+ Taq polymerase DNA mẫu Nƣớc cất 1X 0,2 mM 0,8 pm/ l 3 mM 0,75 U 50 ng
Thêm vào cho đủ 25 l 1X 0,2 mM 1 pm/ l 3 mM 0,75 U 50 ng
Thêm vào cho đủ 25 l 1X 0,2 mM 1,2 pm/ l 3 mM 0,75 U 50 ng Thêm vào cho đủ
25 l
Phƣơng pháp tiến hành: Chọn một mẫu DNA có chất lƣợng tốt, thực hiện phản ứng RAPD với nồng độ và các thành phần nhƣ bảng 3.4. Thực hiện phản ứng RAPD theo chu trình nhiệt ở bảng 3.2.
Định tính kết quả phản ƣ́ng bằng phƣơng pháp điện di : Quan sát độ sáng và độ rõ của các band. Chọn nghiệm thức tốt nhất.
Chỉ tiêu đánh giá kết quả thí nghiệm: Độ sáng, rõ của các band trên gel agarose 2% sau khi tiến hành điện di 50V trong 60 phút.
3.1.5.3. Thực hiện phản ứng RAPD
Phản ứng RAPD sau khi tối ƣu các thành phần phản ứng sẽ đƣợc ứng dụng để đánh giá độ đa dạng di truyền của các giống dứa Cayenne Trung Quốc, Thái Lan, Lâm Đồng tại Tp. Hồ Chí Minh với tất các primer. Sản phẩm RAPD đƣợc kiểm tra kích thƣớc bằng điện di trên gel agarose 2%, trong dung dịch đệm TAE 0,5X, dƣới hiệu điện thế 50V trong 60 phút. Sau đó, gel đƣợc ngâm trong dung dịch ethidium bromide 10 mg/ml và các vạch DNA sẽ đƣợc quan sát dƣới tia UV.
3.1.5.4. Phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYS và Winboot
Sau khi tiến hành điện di sự hiện diện hay vắng mặt của các band trên bảng gel sẽ đƣợc ghi nhận ở mỗi cá thể, đƣợc dùng để phân tích bằng phần mềm NTSYS. Số liệu này sẽ đƣợc sử dụng để xây dựng ma trận tƣơng đồng (Similarity matrix) hoặc ma trận khoảng cách (Distance matrix). Các ma trận này biểu hiện cho mối quan hệ xa gần về mặt di truyền giữa các mẫu phân tích và đƣợc xây dựng trên công thức toán học của Dice (1979).
2a Sxy=
2a +b+c a: Số band chung giữa hai mẫu.
b: Số band mẫu x có mà mẫu y không có. c: Số band mẫu y có mà mẫu x không có. Sxy: Hệ số tƣơng đồng giữa 2 mẫu x và y.
Từ Sxy ta tính đƣợc khoảng cách di truyền giữa x và y: Dxy = 1 – Sxy
Trên cơ sở toán học này, các nhà toán học đã xây dựng các phần mềm WINDIST và NTSYS cho máy tính. Chƣơng trình WINDIST tạo ra ma trận tƣơng đồng từ bộ dữ liệu nhập sẵn. Chƣơng trình NTSYS version 2.1 tạo ra sơ đồ hình cây phản ánh mối quan hệ di truyền giữa các cá thể nghiên cứu (Kangle Zheng và ctv, 1995). Hiện nay 2 chƣơng trình WINDIST và NTSYS đƣợc gộp lại thành chƣơng trình package – NTSYS để tiện dụng hơn.
Cách nhập số liệu:
Dữ liệu thu đƣợc từ sản phẩm PCR sẽ nhập vào excel theo những quy định chung. Nếu nhƣ sản phẩm có band hiện diện thì ta sẽ nhập là 1 và 0 nếu không hiện diện band. Sau khi nhập số liệu, ở ô A3 nhập số “1” (đối với ma trận hình chữ nhật), ô B3 ghi số hàng, ô C3 ghi số cột, và D3 nhập số “0” nếu không có số liệu thiếu. Sau đó, bản số liệu trong excel sẽ đƣợc dùng để xây dựng ma trận tƣơng đồng trong phần mềm NTSYSpc version 2.1. Dùng hệ số DICE để tính mức tƣơng đồng. Sơ đồ
cây phát sinh loài sẽ đƣợc tạo ra khi sử dụng phƣơng pháp UPGMA trong phần mềm NTSYS.
Sau khi có cây phân nhóm di truyền, tiến hành kiểm tra độ tin cậy bằng cách dựng bootstrap bằng phần mềm Winboot. Đây là phần mềm được phát triển bởi Immamnuel V. Yap và Rebecca j. Nelson (1996), có thể tải miễn phí tại trang wep http://www.irri.org/science/software/winboot.asp.
Dữ liệu thu được từ sản phẩm PCR sẽ nhập vào excel tương tự như file excel của phần mềm NTSYS chỉ khác là dữ liệu của các mẫu được trình bày theo hàng ngang: có band hiện diện thì ta sẽ nhập là 1 và 0 nếu không hiện diện band. Ô A1 là số hàng tương đương với số mẫu, ô B1 là số cột tương đương với số band. Chọn hệ số DICE và lặp lại 10000 lần. Phần mềm sẽ cho kết quả là độ lặp lại của các phân nhóm tương đương với độ chính xác của các phân nhóm đó.
3.2.Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa Cayenne 3.2.1. Thời gian và địa điểm 3.2.1. Thời gian và địa điểm
Tiến hành gây nhiễm cho dứa từ tháng 1/2007 tới tháng 8/2007 tại khu nhà lưới bảo vệ thực vật - khoa nông học- ĐH Nông Lâm – Tp. Hồ Chí Minh và bộ nôn Công Nghệ Sinh Học- ĐH Nông Lâm – Tp. Hồ Chí Minh
3.2.2. Đối tƣợng
Rệp sáp đƣợc cung cấp bởi Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật- khoa Nông Học-ĐH Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
Bí đỏ mua tại các chợ ở quận Thủ Đức Tp. Hồ Chí Minh.
Dứa bệnh cung cấp bởi nông trƣờng Pham Văn Hai (Tp. Hồ Chí Minh)
300 cây dứa sạch bệnh virus đƣợc tạo bằng phƣơng pháp nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng (kết hợp xử lý nhiệt) gồm: 100 cây giống Trung Quốc, 100 cây giống Thái Lan, 100 cây giống Lâm Đồng đƣợc cung cấp bởi Bộ môn CNSH (Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh).
3.2.3. Dụng cụ
Hộp nhốt rệp (1x1x1m).
Đèn 5W (dùng để chuyển rệp). Lƣới che (dài 18 m rộng 2 m). Cọ vẽ.
Phòng máy lạnh với nhiệt độ 25-26oC. Cân điện tử.
3.2.4. Phƣơng pháp tiến hành 3.2.4.1. Nuôi rệp 3.2.4.1. Nuôi rệp
Rệp được nuôi theo phương pháp của William Roltsch (2001) [21]: Chủng lên quả bí khoảng 200 rệp/quả (bí nặng khoảng 1,5 Kg). Đặt bí trong thùng giấy và che tối để rệp phát triển. Tiến hành khảo sát nuôi trong điều kiện nhiệt độ là 25-26oC và 33-34oC tại bộ nôn Công Nghệ Sinh Học- ĐH Nông Lâm – Tp. Hồ Chí Minh.
Hình 3.1 Thả rệp lên bí
Tốc độ phát triển của rệp trên bí đƣợc tính dựa và khối lƣợng rệp trên bí sau mỗi tuần (7ngày). Khối lƣợng rệp đƣợc tính bằng cách quét rệp trên bí xuống và cân để định lƣợng.
3.2.4.2. Chuyển rệp từ bí sang dứa bệnh
Dứa bệnh đƣợc lấy tại nông trƣờng Phạm Văn Hai (Tp. Hồ Chí Minh) dựa vào biểu hiện bệnh bên ngoài nhƣ các lá đỏ dần lên, vỏ lụa bung ra, lá kém trƣơng nƣớc,
rìa lá cuốn về phía lƣng, đầu lá cong xuống đất, vỏ rễ tuột ra khỏi phần lõi (Nguyễn Văn Kế, 2001).
Rệp trên bí đƣợc chuyển sang dứa bệnh theo 2 phƣơng pháp:
Dùng đèn: Bí có rệp đƣợc đặt xung quanh cây dứa bệnh. Đặt bóng đèn 5W phía trên dứa bệnh cho rệp tự di chuyển sang. Dứa bệnh đƣợc cắt bớt lá để không cản ánh sáng từ đèn tới bí.
Chuyển rệp trực tiếp: Rệp đƣợc quét trực tiếp bằng cọ vẽ từ bí sang dứa bệnh.
Đánh giá 2 phƣơng pháp dựa vào lƣợng rệp còn sống trên dứa bệnh sau khi chuyển 1 tuần.
Hình 3.2 Dứa bệnh làm nguồn lây PMWaV
3.2.4.3. Chuyển rệp từ dứa bệnh sang dứa sạch bệnh
Dứa bệnh sau đó đƣợc cắt nhỏ thành nhiều mảnh. Mỗi mảnh có khoảng 50 rệp. Các mảnh này sẽ đƣợc đặt lên dứa cần chủng với số lƣợng khoảng 150 con/cây. Vị trí thả rệp là trên 1 lá ở gần gốc dứa vì rệp chủ yếu sống trên các lá dứa sát mặt đất và trên rễ cây dứa.
Dùng lƣới để che nắng để tránh nhiệt độ cao vào buổi trƣa ảnh hƣởng tới sự phát triển của rệp.
Hình 3.3 Vị trí thả rệp lên dứa sạch bệnh
3.3. Xác Định marker RAPD liên kết kiểu hình không biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá trên dứa Cayenne đỏ đầu lá trên dứa Cayenne
3.3.1. Thời gian và địa điểm
Tiến hành từ tháng 7/2007 tới tháng 8/2007 tại phòng thí nghiệm Công nghệ